Isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici del mesencefalo embrionale primario di topo

Prendiamo il tessuto del pavimento del mesencefalo isolato dalla regione ventrale del mesencefalo di embrioni di topo.

Il tessuto è ricco di neuroni dopaminergici in via di sviluppo, che rilasciano il neurotrasmettitore dopamina.

Aggiungere una soluzione enzimatica per abbattere la matrice tissutale, allentando così le cellule.

Aggiungere una soluzione di siero contenente DNasi I e dissociare meccanicamente il tessuto digerito per generare una sospensione cellulare. Le proteine del siero inibiscono gli enzimi, mentre la DNasi I degrada il DNA extracellulare rilasciato durante la lisi cellulare, prevenendo l'aggregazione cellulare.

Lascia che i detriti di tessuto si depositino e trasferisci le cellule sospese in una nuova provetta.

Centrifugare e rimuovere il surnatante, quindi risospendere le cellule in un mezzo neuronale dopaminergico, o DPM.

Prelevare una micropiastra rivestita con un substrato di coltura cellulare al centro dei pozzetti, creando delle micro-isole.

Trasferisci le cellule al centro delle micro-isole per coltivarle ad alta densità.

Incubare, permettendo alle cellule di aderire alle micro-isole.

Riempire i pozzetti con DPM e incubare, facilitando la crescita dei neuroni dopaminergici.

Per impostare colture embrionali primarie di mesencefalo da embrioni di topo embrionali del giorno 13,5, raggruppare tutti i pavimenti del mesentropo raccolti nella stessa provetta da 1,5 millilitri e lavare i campioni tre volte, con 500 microlitri di HBSS privo di calcio e magnesio per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire l'HBSS con tripsina allo 0,5% per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 500 microlitri di DNasi I appena preparata in soluzione FBS al tessuto parzialmente digerito e utilizzare una pipetta di vetro siliconata con punta lucidata a fuoco per triturare il tessuto. Quando si possono osservare solo particelle minuscole e appena visibili, lasciare che questi frammenti di tessuto si depositino sul fondo della provetta per microcentrifuga e trasferire il surnatante in una provetta conica vuota di polipropilene da 15 millilitri.

Aggiungere un millilitro di HBSS alla provetta contenente DNasi I in FBS e mescolare più volte mediante pipettaggio. Trasferire un millilitro di questa soluzione alle particelle di tessuto rimanenti e triturare nuovamente i campioni. Quindi, raggruppare la sospensione cellulare digerita con la provetta di surnatante senza trasferire i frammenti di tessuto rimanenti. Dopo aver triturato il campione di tessuto ancora una volta con la DNasi I rimanente in FBS in HBS, sedimentare le cellule raccolte mediante centrifugazione e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.

Lavare le cellule due volte in due millilitri di terreno neurale dopaminergico riscaldato per lavaggio e risospendere le cellule a 3 x 10⁴ cellule per sei microlitri di concentrazione di terreno fresco e caldo in una provetta da microcentrifuga. Quindi, rimuovere il terreno da ciascuna micro-isola precedentemente preparata e mescolare le cellule con un pipettaggio delicato prima di utilizzare una pipetta da 10 microlitri per aggiungere sei microlitri di cellule a ciascuna micro-isola.

Quando tutte le cellule sono state aggiunte, riempire i pozzetti vuoti ai bordi della piastra con 150 microlitri di acqua o PBS e porre la piastra nell'incubatore per colture cellulari per un'ora. Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura fresca per neuroni dopaminergici a ciascun pozzetto e rimettere la piastra nell'incubatore.