Differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte in cellule progenitrici neurali

Prelevare una micropiastra contenente una coltura aderente di fibroblasti embrionali di topo, o MEF, in un terreno.

I MEF aderenti funzionano come uno strato di alimentazione, fornendo un microambiente di coltura cellulare di supporto.

Rimuovere il terreno e introdurre cellule staminali pluripotenti indotte umane, o hiPSC, in un terreno hiPSC integrato con piccole molecole che migliorano la sopravvivenza cellulare.

Incubare per consentire alle hiPSC di aderire allo strato di alimentazione, che secerne fattori di crescita che facilitano la proliferazione delle hiPSC.

Rimuovere il terreno e aggiungere una soluzione enzimatica per staccare le cellule. Trasferire le cellule e centrifugarle, quindi rimuovere il surnatante e risospenderle nel terreno hiPSC.

Trasferire le cellule su una piastra rivestita di biopolimero. Incubare per consentire ai MEF di aderire.

Trasferire le hiPSC sospese in una micropiastra con fondo a V. Centrifugare le cellule e incubarle, inducendo la formazione di aggregati cellulari.

Reintegrare con un mezzo di differenziazione. I nutrienti del terreno e le interazioni cellula-cellula all'interno dell'aggregato facilitano la differenziazione di hiPSC in cellule progenitrici neurali.

Per questo protocollo, iniziare con la definizione delle celle di alimentazione. Per stabilire questa coltura, è necessario disporre di 600.000 cellule di alimentazione in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, con 300 millilitri di terreno per pozzetto. Dopo aver coltivato le cellule di alimentazione per 48 ore, sostituire il terreno e incubare le piastre per un'ora, mentre si preparano le cellule staminali.

Scongelare le cellule staminali in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Una volta scongelate, trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri e riempire la provetta fino a 5 millilitri con terreno di coltura, aggiunto goccia a goccia. Quindi, centrifugare delicatamente le cellule per quattro minuti. Aspirare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 1 millilitro di terreno di cellule staminali con inibitore ROCK.

Dopo aver quantificato la densità cellulare, piastrate 300.000 cellule staminali sulle cellule di alimentazione. Quindi, far crescere ed espandere le colture, selezionando periodicamente le cellule sane. Dopo l'espansione e il congelamento delle cellule per il backup, far crescere le colonie di cellule staminali su piastre standard fino a raggiungere la confluenza dal 50% al 70%.

Quindi, utilizzare un trattamento enzimatico delicato e una titolazione delicata con un puntale di pipetta da 1 millilitro per raccogliere gli HIPSC per la differenziazione delle cellule precursori neurali. Centrifugare delicatamente la sospensione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 millilitri di terreno iPSC umano. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura cellulare da 5 centimetri rivestita di gelatina allo 0,1% e incubare la piastra per un'ora.

Dopo un'ora, trasferire le cellule non aderenti in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Quindi, sciacquare delicatamente la piastra con 3 millilitri di terreno e trasferirla nello stesso tubo. Successivamente, ripetere la fase di risospensione con una centrifugazione delicata.

Quindi, determinare la densità cellulare e piastrare le cellule in una piastra con fondo a V a 96 pozzetti, a bassa aderenza, a 9.000 celle per pozzetto. Ora, gira la piastra per tre minuti e inizia a coltivare le cellule. Nei successivi 14 giorni, a giorni alterni, sostituire metà del terreno con uno fresco di differenziazione.