Determinazione dell'effetto dell'ormone della crescita sui neuroni della kisspeptina utilizzando un patch clamp a cellula intera

Fissare una fetta ipotalamica di topo transgenico in una camera di registrazione perfusa con aCSF.

La fetta contiene neuroni kisspeptina fluorescenti che esprimono la proteina di fusione, cruciali per la regolazione del sistema riproduttivo.

Assemblare una micropipetta comprendente un elettrodo di registrazione in una soluzione interna.

Localizzare al microscopio un neurone kisspeptina fluorescente.

Applicare una pressione positiva alla pipetta e farla avanzare verso il neurone bersaglio. Al contatto, la pressione crea una rientranza sulla membrana neuronale.

Applicare una breve pressione negativa, formando una tenuta ad alta resistenza tra la micropipetta e la membrana.

Impostare la tensione di mantenimento al potenziale di riposo fisiologico del neurone per misurazioni accurate.

Applicare brevi impulsi di pressione negativa per rompere la membrana, stabilendo una configurazione dell'intera cellula.

Confermare la vitalità del neurone monitorando i parametri.

Introdurre un ormone della crescita di prova, che innesca le vie di segnalazione e induce cambiamenti nel potenziale di membrana del neurone.

Misurare le variazioni del potenziale di membrana per determinare l'effetto inibitorio dell'ormone della crescita sull'attività neuronale.

Trasferire una fetta di cervello di interesse, una alla volta, nella camera di registrazione utilizzando una pipetta di trasferimento in acrilico. Tenere la fetta con un'ancora di fetta in modo che non si muova durante la perfusione aCSF. Posizionare la fetta al centro della camera di registrazione utilizzando l'obiettivo a bassa potenza del microscopio a immersione 10x o 20x.

La posizione della fetta è fondamentale per consentire una buona visione della regione desiderata al microscopio e per una portata perfetta della micropipetta di registrazione. Dopo aver individuato la regione di interesse, passare dalla lente dell'obiettivo alla lente ad alta potenza, 63x, e concentrarsi sul livello del tessuto, osservando la proteina fluorescente endogena e le forme delle cellule nella regione bersaglio per localizzare le cellule della kisspeptina sulla superficie della fetta cerebrale.

Quando viene individuata una possibile cella di destinazione, contrassegnala sullo schermo del computer con il cursore del mouse o disegnando un formato simile a un quadrato sull'area di interesse. Lo schermo del computer contrassegnato aiuta a guidare la posizione della micropipetta di registrazione verso la cellula. Dopo aver determinato la posizione esatta della cella target, sollevare l'obiettivo e introdurre la micropipetta di registrazione riempita con la soluzione interna nel portaelettrodo, assicurandosi che la soluzione interna sia a contatto con l'elettrodo d'argento.

Applicare una pressione positiva prima di immergere la micropipetta nella soluzione aCSF utilizzando una siringa riempita d'aria da 1 a 3 millilitri collegata al supporto della micropipetta attraverso un tubo in polietilene per evitare che i detriti entrino nella micropipetta. Utilizzando il micromanipolatore, guidare la micropipetta sotto il centro dell'obiettivo. Spostare i pulsanti del micromanipolatore per guidare gli assi x, y e z della micropipetta verso la cella di interesse.

Regolare la messa a fuoco per vedere la punta della micropipetta e avvicinare la messa a fuoco, ma non troppo vicino alla fetta. Ridurre la velocità del micromanipolatore e abbassare lentamente la micropipetta sul piano di messa a fuoco, assicurandosi che la punta della micropipetta non penetri bruscamente nella fetta, ma scenda lentamente fino a toccare la superficie della cellula o la regione target.

Applicando una leggera pressione positiva con la siringa riempita d'aria da 1 a 3 millilitri per rimuovere eventuali detriti dal percorso di avvicinamento, spostare lentamente il micromanipolatore sugli assi x, y, z per avvicinare la punta della micropipetta e toccare la cella bersaglio, provocando una fossetta a causa della pressione applicata. Dopo aver stabilito la fossetta, con l'aiuto della modalità di bloccaggio della tensione sul software, applicare una breve aspirazione debole per bocca per 1 o 2 secondi attraverso il tubo collegato al supporto della micropipetta per generare la tenuta tra la micropipetta e la cellula.

Se la guarnizione rimane meccanicamente stabile senza interferenze di rumore per circa un minuto, impostare la tensione di mantenimento al potenziale di riposo fisiologico più vicino della cella di interesse. Per i neuroni ipotalamici kisspeptina, si raccomanda meno 50 millivolt. Quindi, applicare una breve aspirazione per bocca per rompere la membrana plasmatica in corrispondenza della punta della micropipetta sigillata posizionata sulla cellula in modo che la membrana rotta non ostruisca la micropipetta, né attiri una parte considerevole della membrana o la cellula.

Un'adeguata configurazione dell'intera cella può essere ottenuta eseguendo l'aspirazione con una forza sufficiente. Controllare il manuale delle impostazioni di sistema utilizzato. Dopo aver rotto la membrana cellulare, abilitare l'opzione Cella intera in modalità morsetto di tensione e fare clic sul comando automatico facendo riferimento alla scheda Cella intera.

Successivamente, controlla i parametri di vitalità cellulare nel software come descritto nel manoscritto del testo. Monitorare la resistenza della serie e la capacità allo stato stazionario delle celle durante gli esperimenti. Una volta ottenuta correttamente la configurazione dell'intera cella, misurare le correnti sinaptiche in modalità voltage-clamp. Registrare le variazioni del potenziale di membrana a riposo e le variazioni del potenziale di membrana a riposo indotte nella modalità di pinza di corrente.