Risposte postsinaptiche evocate dalla luce nei neuroni di fette di retina di topo

Prendete una fetta di retina di topo adattato al buio all'interno di una camera di registrazione in una stanza buia. La retina si trova su una base artificiale di supporto posta su un vetrino coprioggetti. Perfondere la fetta con aCSF.

La rete neurale retinica comprende fotorecettori sinapticamente legati alle cellule bipolari che fanno sinapsi con le cellule ganglionari.

Posizionare una pipetta di registrazione vicino alla retina.

Al microscopio, applicare una pressione positiva mentre ci si avvicina a una cellula gangliare bersaglio.

Passare alla pressione negativa per inserire un cerotto di membrana, quindi romperlo per stabilire la continuità con il citoplasma.

Al buio, la membrana dei fotorecettori rimane depolarizzata, portando al rilascio di neurotrasmettitori.

I neurotrasmettitori che si legano ai recettori cellulari bipolari innescano la chiusura del canale cationico, inibendo la trasmissione del segnale.

Applicare un impulso luminoso per iperpolarizzare i fotorecettori. La diminuzione del rilascio di neurotrasmettitori innesca l'apertura del canale cationico nelle cellule bipolari.

L'afflusso di cationi induce il rilascio di neurotrasmettitori che si legano ai recettori delle cellule ganglionari, generando un potenziale post-sinaptico eccitatorio registrato dalla pipetta.

Per le registrazioni patch-clamp, adescare i tubi di perfusione con il mezzo di Ames e lasciare che tutte le bolle passino dal tubo. Dopo aver realizzato le pipette di registrazione con un estrattore di vetro, riempire nuovamente il puntale con la soluzione per pipette. Quindi, utilizzare un riempitore per micropipette per riempire circa un terzo della pipetta. Una volta riempita, conservare ogni pipetta in una scatola umida.

Quindi, accendere l'apparecchiatura per le registrazioni patch-clamp, inclusi il computer, l'amplificatore, la fotocamera CCD e il microscopio. Lavorando in condizioni di oscurità, posizionare una preparazione di fette di retina sul tavolino del microscopio con l'aiuto di un visore a infrarossi. Dopo che è stato immobilizzato, iniziare la perfusione continua.

Impostare la temperatura di perfusione da 33 a 37 gradi Celsius. Visualizzate la superficie della fetta con una videocamera CCD. Concentrati sulla posizione di destinazione in cui risiedono i tipi di celle di destinazione. Selezionate una cella dall'aspetto sano per la registrazione con patch-clamp. Una volta identificata una cellula sana, posizionare una pipetta di registrazione in un portapipette e far avanzare la pipetta fino alla preparazione della fetta.

Quando è vicino alla preparazione della fetta, trovare la punta della pipetta con un microscopio. Una volta che la punta della pipetta è visibile al microscopio, spostarla verso il basso verso la cellula target. Quindi, impostare l'amplificatore e regolare la pipetta a picoamp 5 volt per nanoampere. Avviare due impulsi elettrici continui di circa 5 millivolt e circa 10 hertz e controllare la resistenza della pipetta.

Una resistenza ideale è compresa tra 5 e 12 megaohm per la maggior parte dei neuroni retinici. Quando è pronta, utilizzare un boccaglio o una siringa per soffiare la soluzione interna, fino a quando la punta della pipetta non si trova sulla superficie della cellula target. Quando la pressione positiva crea una piccola fossetta sulla superficie della cella, far avanzare leggermente la punta e smettere di soffiare.

Se la resistenza della pipetta è in continuo aumento, lasciarla e monitorare la resistenza fino a quando non raggiunge più di 1 gigaohm. Se la resistenza non aumenta spontaneamente, applicare delicatamente una pressione negativa fino a quando non diventa un gigaseal. Dopo aver raggiunto il gigaseal, modificare il potenziale di mantenimento a 70 millivolt negativi.

Quindi, applicare in modo intermittente una pressione negativa per rompere la membrana all'interno del puntale della pipetta. Quando si effettua la configurazione a cella intera, la resistenza della pipetta può essere compresa tra 500 megaohm e un gigaohm e la corrente capacitiva è osservabile. Registra la relazione I-V da 80 a 40 millivolt negativi. A seconda del tipo di cella, verranno attivati diversi tipi di canali voltaggio-dipendenti. Infine, registra le correnti o le tensioni sinaptiche evocate dalla luce.