Somministrazione sottocutanea di antagonisti muscarinici e Triple-immunocolorazione del lungo muscolo elevatore Auris in topi

L'obiettivo generale di questa procedura è somministrare antagonisti muscarinici ai muscoli LAL di topi adulti ed esaminare i cambiamenti morfologici dei njs in risposta all'inibizione dei recettori colinergici muscarinici. Innanzitutto, gli antagonisti muscarinici vengono somministrati per via sottocutanea con la frequenza e la durata desiderate. Dopo l'eutanasia, i muscoli LAL trattati vengono accuratamente dissecati e ogni tessuto connettivo viene rimosso.

Il tessuto muscolare viene quindi sottoposto a un'etichettatura immuno tripla per visualizzare le cellule di Schwann dei nervi motori e i recettori nicotinici per l'acetilcolina, utilizzando metodi immunohistochimici standard. Infine, si utilizza la microscopia confocale per esaminare le modifiche morfologiche delle giunzioni neuromuscolari nei muscoli trattati con antagonisti muscarinici. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come l'organizzazione morfologica della giunzione neuromuscolare tripartita sia gravemente alterata attraverso l'inibizione dei recettori muscarinici per l'acetilcolina.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la somministrazione di composti farmaceutici ai muscoli scheletrici degli arti posteriori del roditore, ad esempio il gastrocnemio e il tibiale anteriore, è che il muscolo LAL è più accessibile e relativamente sottile. Ciò consente un'applicazione locale ripetuta di farmaci e la visualizzazione di quasi tutti i njs all'interno del muscolo. Su un banco di lavoro pulito con etanolo, sciogliere la dose appropriata di antagonista del recettore colinergico muscarinico in soluzione salina fisiologica sterile in un tubo da reazione da 1,5 millilitri. Aspirare 50 microlitri di soluzione in una siringa per insulina da un cc, utilizzando una siringa separata per ogni topo.

Preparare anche siringhe contenenti solo soluzione fisiologica per ogni topo del gruppo di controllo, mantenendo tutte le siringhe sul ghiaccio fino al momento dell'iniezione. Successivamente anestetizzare i topi con una miscela di chetamina e xilazina. Confermare l'anestesia utilizzando la tecnica della compressione delle dita dei piedi; dopo un'adeguata sedazione, rimuovere i peli che coprono la regione rostrale della testa fino alla regione cervicale e asportare i peli residui con etanolo al 70%. Posizionare il topo sotto un microscopio stereoscopico ed inserire l'ago della siringa parallelamente al muscolo LAL in modo che la punta copra l'aspetto caudale.

Tirare leggermente verso l'alto l'ago della siringa per assicurarsi che l'ago sia inserito nel tessuto connettivo sovrastante e non danneggi direttamente il muscolo LAL. Iniziare a iniettare molto lentamente la soluzione sopra il muscolo LAL destro, ritirando contemporaneamente la siringa nell'arco di circa un minuto. Se l'iniezione viene eseguita correttamente, la soluzione dovrebbe formare una cupola nella pelle sovrastante che permane per almeno un'ora.

Ripetere la procedura ogni 12 ore per uno a sette giorni prima dell'eutanasia e della dissezione muscolare; quindi fissare il topo in una bacinella per dissezione con il dorso rivolto verso l'alto. Effettuare il primo taglio solo attraverso la cute utilizzando piccole forbici a molla per incidere lungo il LAL sinistro dalla regione appena prossimale all'orecchio fino alla regione intorno alla scapola sinistra. Rimuovere con attenzione la cute in questa zona, evitando di tagliare troppo vicino all'orecchio destro poiché costituisce uno dei punti di inserzione per il muscolo LAL destro.

Individuare la striscia centrale di tessuto adiposo lipidico sulla superficie superficiale della testa, nel punto in cui i muscoli LAL destro e sinistro si incontrano, utilizzando forbici a molla di piccole dimensioni. Tagliare un centimetro a destra del tessuto adiposo e procedere verso l'orecchio sinistro a partire dal margine prossimale del muscolo LAL sinistro fino a raggiungere la spalla. Dopo aver effettuato l'incisione, sollevare il muscolo LAL destro con pinzette di piccole dimensioni per esporre la faccia ventrale del muscolo.

Tagliare con cura il tessuto connettivo e la fascia sollevando delicatamente il muscolo LAL destro con una pinzetta. Tagliare intorno all'estremità coddle del LAL destro alla base dell'orecchio e procedere verso l'estremità rostrale dell'orecchio destro. Mantenere il LAL destro girato verso l'alto.

È preferibile includere più tessuto in questo passaggio, piuttosto che rischiare di danneggiare l'LAL stesso. Se il muscolo inizia ad asciugarsi, pipettare un XPBS sopra il muscolo.

Posizionare il LAL destro dissezionato in una piastra per colture da 30 millimetri contenente un XPBS con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Fissare i quattro angoli del muscolo con piccoli perni per insetti utilizzando pinzette e forbici a molla. Rimuovere il tessuto connettivo dalla superficie dorsale del muscolo LAL destro.

Girare il muscolo e ripuntarlo per pulire la superficie ventrale. Da due a tre muscoli possono essere posizionati nella stessa piastra da 30 millimetri per una tripla colorazione immunoistochimica dopo la notte. Incubazione con l'anticorpo primario.

Lavare i muscoli in una volta XPB S3 per 3 volte per 10 minuti ciascuna, quindi aggiungere il cocktail di anticorpi secondari nella soluzione di blocco per un'ora. A temperatura ambiente, mantenere i muscoli in incubazione protetti dalla luce per prevenire il fotocandeggiamento; dopo un'ora di incubazione, lavare i muscoli in una volta XPB S3 per 3 volte per 10 minuti ciascuna. Mantenendo i muscoli ricoperti con una soluzione fresca di XPBS dopo l'ultimo lavaggio sotto il microscopio stereoscopico, rimuovere eventuali tessuti connettivi residui e quindi tagliare i margini laterali del LAL.

Montare il tessuto muscolare sul vetrino con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Aggiungere quindi due o tre gocce di mezzo di montaggio. Applicare i coprioggetti di vetro e fissarli con smalto trasparente per unghie.

Proteggere i vetrini dalla luce e conservarli a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'analisi. Viste al confocale ad alta magnificazione di una colorazione immunotripla della giunzione neuromuscolare del topo mostrano la sua organizzazione tripartita. I fini rami terminali, che si sviluppano da un singolo assone colorato con NFS V due, sono strettamente ricoperti dai corpi cellulari delle cellule di Schwann terminali e dai loro prolungamenti, come rivelato dalla colorazione per S 100 a livello postsinaptico.

Una fibra muscolare, un gruppo di recettori nicotinici per l'acetilcolina è precisamente opposto ai rami delle terminazioni nervose e alle cellule di Schwann terminali. Il muscolo LAL di un topo trattato con veicolo mostra njs, la cui organizzazione tripartita non è alterata e presenta gli alberi altamente differenziati tipici della terminazione nervosa, come mostrato dalla colorazione immunoistochimica tripla. Al contrario, l'integrità strutturale e funzionale di questa organizzazione tripartita è gravemente alterata dall'applicazione quotidiana di quattro damp.

Un inibitore specifico del sottotipo del recettore colinergico muscarinico. Qui, quattro impulsi umidi provocano l'eliminazione selettiva delle terminazioni nervose da numerose giunzioni neuromuscolari distribuite su tutta la superficie muscolare. Inoltre, le cellule di Schwann terminali risultano anormalmente quiescenti, come dimostrato da un'intensa marcatura per S100 in assenza di estensione dei prolungamenti.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come somministrare antagonisti muscarinici ai muscoli LAL ed eseguire una tripla immunomarcatura dei muscoli per esaminare le modifiche morfologiche dei njs in risposta all'inibizione di questi recettori.