JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:59 min. • July 8th, 2025
Fissare una fetta di cuneo cerebrale di topo transgenico in una camera di registrazione perfusa con aCSF ossigenato.
Il lato del cuneo più spesso contiene la radice nervosa uditiva e il nucleo cocleare, comprese le cellule cespugliose stellate T e globulari.
Il lato più sottile contiene il nucleo mediale e ventrale del corpo trapezoidale con neuroni olivocochlorici mediali fluorescenti.
Localizzare al microscopio la radice del nervo uditivo e posizionare un elettrodo stimolante su di essa.
Identificare un neurone olivocochlear mediale fluorescente e far avanzare una pipetta di registrazione verso di esso.
Applicare il patch al neurone per ottenere una configurazione dell'intera cellula e registrare la sua attività elettrica.
Applicare impulsi elettrici alla radice del nervo uditivo, attivando le cellule del nucleo cocleare.
Le cellule T stellate attivate rilasciano neurotrasmettitori eccitatori ai neuroni olivocochloari mediali.
Tuttavia, le cellule cespugliose globulari attivano vie inibitorie, rilasciando neurotrasmettitori inibitori ai neuroni olivocochlosi mediali.
L'integrazione dei segnali eccitatori e inibitori provoca correnti postsinaptiche, confermando l'attività neuronale all'interno della fetta.
Per impostare la fetta a cuneo per l'analisi elettrofisiologica, posizionare il campione in una camera di registrazione che viene continuamente perfusa con 35 gradi Celsius aCSF e stabilizzare la fetta. Utilizzando l'ottica DIC, concentrarsi sulla radice del nervo uditivo sul lato spesso della fetta e utilizzare un micromanipolatore per spostare l'elettrodo stimolante il tungsteno bipolare sulla radice del nervo uditivo e delicatamente sulla superficie del tessuto.
Sposta il campo visivo sul nucleo ventrale del corpo trapezoidale sul lato sottile e seleziona un neurone olivocochlear mediale come bersaglio per l'elettrofisiologia patch-clamp sotto epifluorescenza utilizzando un filtro di emissione a 561 nanometri. Riempire una pipetta di registrazione con la soluzione interna appropriata per l'esperimento proposto e, sotto ottica DIC, applicare il patch e registrare dal neurone olivocochlear mediale nella configurazione a cellula intera.
Regolare l'ampiezza della stimolazione elettrica della radice nervosa uditiva per ottenere eventi postsinaptici coerenti nel neurone olicocleare mediale. Quindi, eseguire protocolli di stimolazione appropriati per osservare le correnti sinaptiche evocate nei neuroni olivocochloari mediali.