Modellazione del danno neuronale nei neuroni dei granuli cerebellari primari di topo

Iniziare con una coltura di neuroni di granuli cerebellari primari di topo.

Aggiungere alte concentrazioni di N-metil-D-aspartato, o NMDA, un agonista del recettore dei neurotrasmettitori eccitatori, e glicina, un co-agonista. Incuba la cultura.

NMDA e glicina si legano ai rispettivi siti sui recettori NMDA, portando a una sovrastimolazione e causando un massiccio afflusso di ioni calcio.

L'aumento del calcio intracellulare attiva le fosfolipasi calcio-dipendenti, che degradano i fosfolipidi della membrana cellulare, con conseguente danno alla membrana.

Inoltre, il calcio intracellulare attiva le proteasi che degradano le proteine cellulari.

Gli elevati livelli di calcio inducono anche stress e frammentazione mitocondriale, portando al rilascio di specie reattive dell'ossigeno, o ROS, e causando stress ossidativo.

Inoltre, il calcio intracellulare attiva le DNasi, che, insieme ai ROS, causano danni al DNA, con conseguente morte neuronale.

Sostituire il terreno con un terreno fresco senza NMDA e glicina per arrestare la cascata di segnalazione.

Il modello di lesione neuronale indotta da NMDA è pronto per ulteriori analisi.

Per indurre eccitotossicità neuronale con NMDA, dopo sette giorni in vitro, trattare i neuroni dei granuli cerebellari con 100 NMDA micromolare e 10 glicina micromolare per un'ora. Quindi, sostituire il terreno con un terreno condizionato proveniente dalle colture parallele senza trattamento. Questa concentrazione provoca il 50% di morte cellulare 24 ore dopo il trattamento.