Name: La chiusura del tubo neurale in Cultura embrione di topo intero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Impara a coltivare embrioni di topo interi per studiare la chiusura del tubo neurale e l'allungamento dell'asse neurale in condizioni controllate. Questa tecnica consente la manipolazione farmacologica diretta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare il laboratorio di A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) e il laboratorio di L. Niswander (U of Colorado at Denver) per un parere utile con le tecniche di dissezione e la cultura. Questo lavoro è stato sostenuto da NRSA NS059562 a JDG e RO1NS05897 di MER, in collaborazione con L. e J. Niswander Nadeau (Institute for Systems Biology).

1. Preparazione di terreni di coltura - tutti i reagenti sono elencati nella tabella 1 <ol><li> Scongelare siero ratto maschio a 37 ° C. </li><li> Calore Disattiva siero di ratto per 30 minuti a 55 ° C </li><li> Centrifugare siero ratto a 10K per 5 minuti a temperatura ambiente </li><li> Rimuovere il surnatante 50:50 e mescolare con fenolo-rosso senza DMEM w / glucosio </li><li> Sterilizzare i media usando un filtro da 0,45 um siringa </li><li> Almeno 1 ml di media / embrione deve essere preparato </li></ol> 2. Isolamento dell'utero dalla diga incinta <ol><li> Utilizzando le procedure approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC), la diga incinta viene prima anestetizzato e poi sacrificati per dislocazione cervicale </li><li> Sterilizzare l'addome con il 70% EtOH </li><li> Pinch un piccolo sentiero di pelle lungo la linea mediana, appena sopra la linea capezzolo, con una pinza grande e aperto l'addome sotto il tuo pinze con le forbici di grandi dimensioni. Fare attenzione a non danneggiare le strutture internes </li><li> Usa la tua forbici per tagliare lateralmente dalla apertura iniziale verso entrambi i lati del mouse in modo che l'intero addome è aperto </li><li> Intestini e cuscinetti di grasso in eccesso possono spesso oscurare l'utero e questi dovrebbero essere spostati da parte in modo che la parte superiore dell'utero e delle ovaie può essere osservato da ogni lato </li><li> Pizzicare la parte superiore dell'utero sotto le ovaie e utilizzare le forbici per separare l'utero dal grasso, il taglio da un capo dell 'utero all'ovaio altri </li><li> Estrarre l'utero con il forcipe e posto in una capsula di Petri con soluzione salina </li></ol> 3. Rimozione di embrioni dall'utero <ol><li> Risciacquare l'utero con soluzione fisiologica per rimuovere il sangue in eccesso e tagliare il grasso in eccesso dall'esterno </li><li> Trasferire su un piatto pulito, con temperatura ambiente. Tyrodes salina per migliorare la visualizzazione </li><li> Utilizzando uno stereomicroscopio, separare ogni embrione utilizzando piccole forbici o, se necessario, sottile (# 5) pinze a cura sbucciare l'utero a parte. </li> &lt;li&gt; Inserire una pinza sottile nello spazio tra la parete uterina e la decidua e staccare la parete uterina, facendo attenzione a non forare l'embrione </ol> 4. Rimozione di decidua da embrioni <ol><li> Orientare la decidua modo che la parte più scura (placenta) è rivolto verso di voi </li><li> Fare un'incisione con il forcipe, lungo la linea che separa la parte oscura della decidua dalla parte più leggera, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità </li><li> Completa la separazione della placenta dalla parte superiore del sacco vitellino, facendo attenzione a non strappare la ectoplacental cono (EPC). A questo punto dovreste essere in grado di visualizzare la membrana REICHERTS sul sacco vitellino </li><li> Continuare a rimuovere l'intero decidua (più leggero porzione) facendo attenzione a non forare il sacco vitellino </li><li> Premere leggermente e rimuovere il REICHERTS da peeling lontano dalla EPC. Se l'EPC è danneggiato o separato dal sacco vitellino, gli embrioni non riuscirà a girare normalmente da E8.5-E9.5 </li><li con il reicherts rimosso l deve essere facilmente visibile attraverso sacco vitellino e pu messo in scena da somities conteggio.></ol> 5. Configurazione del sistema cultura <ol><li> Tagliare l'estremità di una pipetta di trasferimento di plastica con le forbici per aumentare il diametro dell'apertura in modo che un embrione può essere pipettati senza danneggiare il sacco vitellino </li><li> Riempimento di bottiglie rullo pulito con 1 ml di supporti per embrione. A seconda del tipo di bottiglie a rulli utilizzati un massimo di 3-6 embrioni possono essere caricati in ogni bottiglia. </li><li> Trasferire gli embrioni usando il tuo pipetta taglio ai media pieni di bottiglie rullo, riporto quanto Tyrodes meno possibile per non diluire i media </li><li> Fissare il tappo di gomma (tappo) per la parte superiore della bottiglia di vetro rullo </li><li> Inserire il rullo di bottiglie nel tamburo cultura rullo in modo che una tenuta stagna è formata tra la spina e il tamburo </li><li> Una volta che tutte le bottiglie sono stati attaccati, e qualsiasi slot vuoti nel tamburo sono stati sigillati wtappi in gomma esima, attivare il rullo </li><li> Aperto di CO 2 e O 2 serbatoi e regolare a circa 2 bar, in modo che la valvola di scarico sta rilasciando una bolla al secondo. Per E8.5-E10 embrioni, il 20% O 2 e il 5% di CO 2 dovrebbe essere usato. </li><li> Assicurarsi che l'incubatore è impostato a 37 ° C e coprire o chiudere l'incubatore in modo che gli embrioni siano al riparo dalla luce. </li><li> Gli embrioni devono essere controllati periodicamente per valutare il loro sviluppo con l'aggiunta di somities, la progressione della svolta, e l'estensione della chiusura del tubo neurale </li><li> Dopo 2-3 ore di cultura, gli inibitori farmacologici o altri trattamenti possono essere aggiunti ai media </li><li> Il disegno dello studio dovrebbe comprendere i controlli, come veicolo o analoghi inattivi di reagente studio. </li></ol> 6. Valutare lo sviluppo dopo la coltura degli embrioni intero <ol><li> Spegnere il gas, arresto a rullo e rimuovere bottiglie da incubatore </li><li> Embrioni trasferimento a Tyrodes o PBS in una capsula di Petri per la valutazione sotto stereomicroscopio </li><li> Il sacco vitellino dovrebbe apparire simili a palloncini, un battito cardiaco dovrebbe essere visibile e la frequenza cardiaca deve essere&gt; 120 battiti al minuto, e la circolazione dovrebbe essere evidente </li><li> Embrioni fotografia prima della rimozione sacco vitellino, se necessario, </li><li> Rimuovere sacco vitellino da embrione, tagliando un foro vicino l'EPC e lanciando il sacco vitellino e amnios sopra la testa e groppa dell'embrione. </li><li> Il cordone ombelicale può essere tagliato per separare il sacco vitellino dall'embrione, e il sacco vitellino può essere utilizzata per la genotipizzazione l'embrione, se necessario. </li><li> Esaminate l'embrione per numero somite e difetti del tubo neurale, come pieghe del cranio aperto, chiusura incompleta del viso e / o un neuropore aperto caudale. Gli embrioni possono essere allestita secondo la classificazione Theiler di cambiamenti morfogenetici multiple ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ Emap / home.html</a> ) Ancora una volta, un archivio fotografico disviluppo embrionale è utile. </li></ol> 7. Note <ol><li> Una dissezione di alta qualità è essenziale, perché ogni nick o lacrime nel sacco vitellino impedirà di svolta e di successo inibire il normale sviluppo. L'EPC possono essere danneggiati durante la rimozione della membrana di Reichert (RM), e se l'EPC è anche parzialmente separato dal sacco vitellino, gli embrioni non si sviluppano normalmente. Tuttavia, la rimozione incompleta della RM può causare embrioni per stare insieme e / o RM possono invadere le cellule in coltura e restringono l'espansione sacco vitellino, entrambi che impedirebbe il normale sviluppo. </li><li> Pinze pulite e nitide sono il segreto per ottenere una dissezione bene, perché forcipe opaco o piegato rendere la procedura molto più difficile. Depositi di proteine ​​su strumenti porterà a danni ai tessuti. </li><li> Pulito, bottiglie di vetro sterile sono essenziali anche per evitare che gli embrioni di attaccarsi alla parete laterale e di essere danneggiati. Prima di iniziare l'esperimento, le bottiglie devono essere scrubbed con acqua e sapone, risciacquati in dH 2 O, microonde e con una piccola quantità di acqua in ogni bottiglia fino a quando l'acqua bolle. Bottiglie vengono poi risciacquati con il 70% EtOH e lasciato asciugare all'aria. </li><li> Lavorare il più velocemente possibile, perché la prima l'embrione può essere trasferito ai media cultura e riscaldato di nuovo a 37 ° C la sopravvivenza migliore. </li><li> Dissezione completa l'intera cucciolata prima di trasferire tutti gli embrioni alle bottiglie rullo in modo che ogni embrione è a temperatura ambiente per la stessa quantità di tempo per evitare di creare qualsiasi discrepanza nella crescita dell'embrione </li><li> Mantenere un ambiente sterile, per evitare la contaminazione batterica delle culture. I nostri esperimenti cultura sono stati effettuati senza antibiotici, ma molti laboratori aggiungere antibiotici alla loro mezzi di comunicazione per prevenire la crescita batterica. Il mezzo dovrebbe apparire più chiaro alla fine dell'esperimento come era all'inizio dell'esperimento. Se il supporto è diventato nuvoloso o c'è un precipitato visibile, è probabile una truffacontaminazione che ha infettato la vostra cultura. </li><li> Lo scambio di gas inefficaci può anche ritardare lo sviluppo degli embrioni, in modo da essere sicuri di avere un regolatore affidabile che garantisce la consegna continua. </li><li> Gli embrioni si sviluppano circa il 50% più lento nella cultura ex vivo, quindi è indispensabile contare somiti per assicurarsi di aver raggiunto l'adeguato livello di sviluppo per il completamento della sperimentazione. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: La comparsa degli embrioni pre-e post-roller cultura è illustrato nella figura 1. Al momento della dissezione, degli embrioni dovrebbe essere in una configurazione intentato (Fig. 1 A, D), dove la coda si trova dietro le pieghe testa. Dopo 36 ore di cultura, gli embrioni devono aver completato girando in modo che siano in C-curva, posizione fetale, in cui la coda è di fronte al capo (Fig. 1B, C, E, F). Manipolazione farmacologica con RhoA inibitore della chinasi (Y-27632), un noto inibitore di estensione convergente duranteneurulazione (Ybot-Gonzalez, 2007), si traduce in un accorciamento degli embrioni lungo il loro asse rostro-caudale (Fig. 1E, F) e inibisce la chiusura del cranio neurale volte. I nostri dati mostrano che dosi crescenti di Y-27632 compromette progressivamente cranica chiusura volte (Figura 2A) e riduce l'asse del corpo (Fig. 2B), in coerenza con il ruolo di valle RhoA segnalazione in neurulazione cranico ed estensione convergente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg"> Figura 1. Aspetto di embrioni culture e di manipolazione con l'inibitore farmacologico Y-27632. (A, D) embrioni Dissected a E8.5 prima della coltura degli embrioni interi (B, E) Gli embrioni in E10 con il sacco vitellino ancora intatto, a seguito 36hrs della cultura rullo. (C, F) Il sacco vitellino è stato rimosso per illustrare il successo di svolta e la chiusura del tubo neurale. Embrioni che sono stati trattati con l'inibitore della chinasi Rho Y-27632 (E, F) non è riuscito a sottoporsi corretta estensione convergente e illustrareun asse del corpo ridotto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg"> Figura 2. Effetto inibitore della chinasi RhoA sul cranio di chiusura del tubo neurale e di allungamento dell'asse. (A) La percentuale di embrioni che sono stati in grado di chiudere con successo la loro pieghe cranica (NTC% = percentuale di chiusura del tubo neurale) viene confrontato con la dose di Y-27632 aggiunto al mezzo di coltura. (B) La distanza tra vescicola otica e arti anteriori è stato notevolmente ridotto a dosi crescenti di Y-27632 (p &lt;.05).

<ol><li>Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCockroft%2C+DL+%22Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).</li>
<li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).</li>
<li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%2C+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li>
<li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interactions%2C+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La possibilità di separare materno, i fattori intrauterina da quelli che sono intrinseci all&#39;embrione durante il suo sviluppo è uno strumento importante per studiare tutte le fasi della embriogenesi. Qui abbiamo analizzato gli effetti di un inibitore della chinasi piccola molecola RhoA in utero cranica ex neurulazione, eliminando così la variabile del metabolismo materno del farmaco. Questa manipolazione farmacologica ha un profondo effetto sulla neurulazione cranica ed estensione convergente. Sensibilità a questo composto può essere confrontato fra i differenti mutanti di topo genetica. Il metodo qui presentato può essere applicato anche agli studi di altre vie molecolari in fase di sviluppo, permettendo la manipolazione diretta della funzione cellulare in embrioni usando una varietà di reagenti.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Stereomicroscopio per dissezione </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore di precisione </td><td> BTC Ingegneria (UK) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Rotazione Bottiglia dell&#39;Unità Cultura </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Bottiglie di vetro per rotante Unità </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Bung </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Cork </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler ingresso </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Bubbler gas in ingresso trappola </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler uscita </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Bombola di gas </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% di O 2, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Regolatore del gas </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat Serum maschio </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM w / o rosso fenolo </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro siringa </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Grande Forbici dissezione (Blunt punta) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Bonn Forbici </td><td> Belle Strumenti Scientifici (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 pinze </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode di Saline </td><td></td><td></td><td> Come descritto in Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> Piatto 10 centimetri Petri monouso </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

la chiusura del tubo neurale in cultura embrione di topo intero

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Modelli murini genetiche sono uno strumento importante per lo studio dei mammiferi chiusura del tubo neurale (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Tuttavia, lo studio di embrioni di topo in utero è limitata dalla nostra incapacità di farmacologicamente direttamente manipolare gli embrioni in modo isolato dagli effetti del metabolismo materno sul reagente di interesse. Sia che si utilizzi una piccola molecola, proteine ​​ricombinanti, o siRNA, la consegna di queste sostanze alla madre, attraverso la dieta o per iniezione saranno oggetto questi composti instabili ad una varietà di difese corporee che potrebbero impedire loro di raggiungere l&#39;embrione. Studi effettuati su colture di embrioni intero può essere usato per separare materna da intrinseca effetti sullo sviluppo fetale. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura embrioni di topo usando sostanze altamente arricchito in un apparecchio rotante incubatore che consente di normale chiusura del tubo neurale dopo la dissezione (Crockett, 1990). Una volta in coltura, gli embrioni possonoessere manipolato con tradizionali tecniche in vitro, che altrimenti non sarebbero possibili se gli embrioni erano ancora in utero. Fratelli embrione può essere raccolte in vari momenti per studiare diversi aspetti del neurulazione, che si verificano da E7-7.5 (formazione di placca neurale, appena prima l&#39;inizio della neurulazione) per E9.5-10 (al termine del cranio neuropore piega e caudale chiusura, Kaufman, 1992). In questo protocollo, dimostriamo il nostro metodo per sezionare embrioni a timepoints che sono ottimali per lo studio del neurulazione cranica. Embrioni saranno sezionati a E8.5 (circa 10-12 somities), dopo l&#39;inizio della chiusura del tubo neurale, ma prima di accendere embrione e la chiusura del cranio neurale piega, e mantenute in coltura fino a E10 (26-28 somities), quando cranico neurulazione dovrebbe essere completa.

Un metodo che consente la manipolazione diretta farmacologica di embrioni di topo durante neurulazione che aggira il metabolismo materno è descritto. La tecnica può essere adattata per studiare diversi aspetti della neurulazione variando il punto di tempo e agente farmacologico.

La chiusura del tubo neurale in Cultura embrione di topo intero

I modelli murini genetici rappresentano uno strumento importante nello studio della chiusura del tubo neurale nei mammiferi (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Tuttavia, lo studio del topo...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare gli eventi di sviluppo dell'embrione di topo, in particolare l'allungamento dell'asse neuro e la chiusura del tubo neurale, in un ambiente extrauterino in cui le condizioni possono essere definite. Questo viene ottenuto rimuovendo innanzitutto le corna uterine dal topo gravido anestetizzato al giorno gestazionale o embrionale 8,5. Successivamente, singoli embrioni di topo vengono prelevati dall'utero mantenendo intatto il sacco vitellino e gran parte della decidua.Quindi il tessuto deciduale extra-embrionale viene asportato, lasciando intatto il cono ectoplacentario. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel trasferire gli embrioni nel loro sacco vitellino in bottiglie rotanti contenenti mezzo con o senza agenti farmacologici in fase di studio e coltivare gli embrioni per 18-24 ore in un incubatore con aerazione continua. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'aggiunta progressiva di somiti, l'apposizione delle pieghe neurali e la chiusura con il ripiegamento dell'embrione nella caratteristica curvatura a "C" della posizione fetale.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo, ad esempio quali vie molecolari sono coinvolte nella chiusura normale del tubo neurale. Quali agenti o integratori possono favorire la normale ovulazione, specialmente negli embrioni che presentano mutazioni genetiche che li predispongono a difetti del tubo neurale o DNT. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale poiché i passaggi della dissezione possono risultare molto complessi.Gli embrioni sono piccoli e possono essere facilmente danneggiati, e il danno al sacco vitellino può compromettere lo sviluppo somitico, la rotazione e anche lo sviluppo del sistema circolatorio, impedendo un esito positivo. Per iniziare, preparare il mezzo di coltura scongelando il siero di ratto maschio a 37 gradi Celsius. Successivamente, inattivare il siero di ratto per 30 minuti a 55 gradi Celsius.Quindi centrifugare a 10.000 giri al minuto per cinque minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il soprannatante e mescolarlo in rapporto uno a uno con DMEM privo di rosso fenolo e con alto contenuto di glucosio. Sterilizzare il mezzo utilizzando un filtro siringa da 0,45 micron.Isolare l'utero e collocarlo in una piastra di Petri con soluzione fisiologica per rimuovere gli embrioni. Innanzitutto, risciacquare l'utero con soluzione fisiologica per eliminare qualsiasi sangue in eccesso e asportare il grasso residuo dalla superficie esterna. Trasferirlo quindi in una piastra pulita contenente soluzione fisiologica di Tyrode a temperatura ambiente per migliorare la visualizzazione al microscopio stereoscopico, mantenendo le mani stabilizzate sul piano dello strumento.Utilizzare forbici piccole o pinzette fini per separare l'utero ed estrarre ciascun embrione. Inserire la pinzetta fine nello spazio tra la parete uterina e la decidua, quindi staccare delicatamente la parete uterina applicando una tensione minima per evitare la rottura del sacco vitellino. Successivamente, posizionare la decidua in modo che la placenta sia rivolta lontano da voi.Quindi effettuare un'incisione con la pinza lungo la linea, separando la porzione scura della decidua da quella più chiara, avendo cura di non tagliare troppo in profondità. Completare la separazione della placenta dalla sommità del sacco corionico.Avendo cura di non strappare il cono ectoplacentario o EPC. A questo punto, la membrana di Riker sulla sacca vitellina dovrebbe essere visibile. La rimozione della membrana di Riker dalla sacca vitellina è la parte più difficile della procedura e richiede pazienza e mano ferma.Per rimuovere con delicatezza il sacco corionico senza danneggiare il sacco vitellino sottostante, continuare a rimuovere l'intera decidua. Facendo attenzione a non perforare il sacco vitellino, pizzicare delicatamente e rimuovere la membrana corionica staccandola dall'EPC. Se l'EPC viene danneggiato o si separa dal sacco vitellino, gli embrioni non riusciranno a girarsi normalmente da E 8,5 a E 9,5.Dopo aver rimosso la membrana di Riker, l'embrione dovrebbe essere facilmente visibile attraverso la sacca coriacea. Determinare lo stadio dell'embrione contando i somiti lungo un lato, partendo al di sotto della vescicola otica e terminando alla coda con le forbici. Tagliare l'estremità di una pipetta di trasferimento in plastica per utilizzarla sull'embrione senza danneggiare la sacca coriacea.Riempire flaconi roller puliti con un millilitro di mezzo per embrione. A seconda del tipo di flaconi roller utilizzati, è possibile caricare fino a tre-sei embrioni per flacone. Utilizzando la pipetta tagliata, trasferire gli embrioni nel flacone roller contenente il mezzo, portando con sé il minor quantitativo possibile di tyros, al fine di non diluire il mezzo.Collegare il tappo di gomma alla sommit&agrave; della bottiglia di vetro per rotazione. Inserire le bottiglie per coltura rotante nel tamburo della coltura rotante in modo da formare una chiusura ermetica tra il tappo e il tamburo. Una volta che tutte le bottiglie sono state collegate, sigillare eventuali alloggiamenti vuoti nel tamburo con tappi di gomma.Quindi attivare il rullo. Successivamente, aprire la bombola di premiscelazione di CO2 e O2 e regolarla a circa due PSI in modo che la valvola di uscita rilasci una bolla al secondo. Per embrioni E 8,5 ed E 10, si dovrebbe utilizzare il 20% di O2 e il 5% di CO2.Assicurarsi che l'incubatrice sia impostata a 37 gradi Celsius e coprirla o chiuderla in modo da proteggere gli embrioni dalla luce. Per valutare lo sviluppo dell'embrione, controllarli periodicamente per verificare l'aggiunta di somiti, il progredire del ripiegamento e il grado di chiusura del tubo neurale dopo due o tre ore di coltura; se desiderato, aggiungere inibitori farmacologici o altri trattamenti. Al termine dell'incubazione, spegnere il gas, fermare il rullo ed estrarre le bottiglie dall'incubatrice.Trasferire gli embrioni nuovamente in tyros o PBS in una piastra di Petri. Sotto il microscopio stereoscopico, la sacca vitellina dovrebbe apparire gonfia come un palloncino, il battito cardiaco dovrebbe essere visibile e la circolazione dovrebbe risultare evidente. Rimuovere la sacca vitellina dall'embrione praticando un foro vicino alla EPC e ribaltando la sacca vitellina e l'amnios sopra la testa e il dorso dell'embrione. Tagliare il cordone ombelicale per staccare la sacca vitellina dall'embrione.Infine, esaminare l'embrione per verificare il numero di somiti e la presenza di difetti del tubo neurale, come pieghe craniali aperte, chiusura incompleta del volto e/o un neuroporo caudale aperto. Gli embrioni possono essere stadiati secondo la classificazione di Tyler, basata su diversi cambiamenti morfogenetici. L'aspetto degli embrioni prima e dopo la coltura su rulli è illustrato qui al momento della dissezione. L'embrione dovrebbe presentarsi in una configurazione non girata, con la coda situata dietro le pieghe della testa.Dopo 24 ore di coltura, gli embrioni dovrebbero aver completato il ripiegamento assumendo una posizione fetale curva a C, in cui la coda si trova davanti alla testa. L'immagine mostra nella riga superiore lo sviluppo di embrioni senza l'aggiunta di inibitori. La riga inferiore mostra l'effetto della manipolazione farmacologica con l'inibitore della chinasi A Y 2 76 32, un noto inibitore dell'estensione convergente durante l'alaizione.Questo inibitore provoca un accorciamento degli embrioni lungo l'asse caudale e inibisce la chiusura delle pieghe neurocristiche craniche. I nostri dati mostrano che dosi crescenti di Y 2 7 6 3 2 compromettono progressivamente la chiusura delle pieghe craniche e accorciano l'asse corporeo, in accordo con il ruolo della via di segnalazione downstream di row. Una volta acquisita, la tecnica di dissezione può essere completata in 60-90 minuti per una nidiata di sei-dodici embrioni.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dei passaggi necessari per coltivare embrioni di topo dal giorno di gestazione otto e mezzo al giorno dieci allo scopo di studiare i meccanismi dello sviluppo a livello sistemico.

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo protocollo video mostra l'applicazione del test neurosfere per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali da eminenze gangliari del giorno embrionale 14-topo cervello.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

Isolamento di embrionale cresta neurale dal tubo neurale facilita l'uso...

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

Il mesenchima cranica subisce movimenti morfogenetici drammatici che fornisce probabilmente una forza trainante per l'elevazione delle pieghe...

Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

Qui sviluppiamo gli strumenti necessari...

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l'esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

La coltura di embrioni interi di mammiferi (WEC) è ampiamente utilizzata in teratologia e biologia dello sviluppo. Il siero di ratto immediatamente centrifugato è comunemente fornito come terreno sia per la WEC di topo che di ratto. In questo video, dimostriamo il nostro protocollo standard per la preparazione di siero di ratto di alta qualità adatto alla WEC dei mammiferi.

Preparazione di Rat Siero Adatto per mammiferi tutta la cultura Embrione

Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

In questo protocollo, descriviamo come iniettare lentivirus nella cavità amniotica del topo a E7.5, portando a una trasduzione uniforme dell'intera piastra neurale, con effetti dannosi minimi sulla sopravvivenza o sullo sviluppo embrionale.

Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5

Una piattaforma potenziata per la coltura di embrioni interi consente uno sviluppo continuo e robusto in ex utero di embrioni di topo post-impianto per un massimo di sei giorni, dalle fasi di pre-costruzione fino all'organogenesi avanzata. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio la procedura standard per la coltura embrionale di successo utilizzando piastre statiche e sistemi di bottiglie rotanti.

Ex Utero Coltura di embrioni di topo dalla pregastrulazione all'organogenesi avanzata

Questo protocollo è stato sviluppato per monitorare longitudinalmente le proprietà meccaniche del tessuto della placca neurale durante la neurulazione dell'embrione di pulcino. Si basa sull'integrazione di un microscopio Brillouin e di un sistema di incubazione sul palco, che consente l'imaging meccanico dal vivo del tessuto della placca neurale in embrioni di pulcino in coltura exovo .

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Impara a coltivare embrioni di topo interi per studiare la chiusura del tubo neurale e l'allungamento dell'asse neurale in condizioni controllate. Questa tecnica consente la manipolazione farmacologica diretta.

La chiusura del tubo neurale in Cultura embrione di topo intero

Esplora altri video