Determinazione dell'interruzione della barriera emato-encefalica utilizzando coloranti fluorescenti in un modello murino EAE

Iniziare con una soluzione contenente colorante fluorescente verde legato a una grande catena di destrano. Quindi, aggiungere una soluzione di colorante rosso legata a una piccola catena di destrano.

Mescolare accuratamente i coloranti e metterli in una siringa.

Iniettare questa miscela di colorante per via endovenosa in un topo anestetizzato attraverso il seno retro-orbitale, una vena dietro l'occhio.

Questo topo soffre di encefalomielite autoimmune sperimentale o EAE.

In questa condizione, la barriera emato-encefalica è disturbata da giunzioni strette indebolite tra le cellule endoteliali dei vasi sanguigni del cervello con spazi vuoti.

Consentire al topo di svegliarsi completamente e riacquistare la motilità, consentendo ai coloranti di circolare.

Il colorante rosso con la piccola catena di destrano si diffonde facilmente attraverso le piccole fessure nel tessuto cerebrale, mentre il colorante verde legato alla grande catena di destrano si diffonde se il danno è grave.

La quantità di ciascun colorante fluorescente nel tessuto cerebrale è correlata all'entità della rottura della barriera emato-encefalica.

Per preparare le soluzioni madre di destrano, sciogliere 10 milligrammi di tre kilodalton di destrano Texas Red in 500 microlitri di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e 5 milligrammi di 10 kilodalton di destrano AlexaFluor 488 in 250 microlitri di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%.

Per la soluzione di lavoro del destrano, appena prima dell'iniezione, pipettare 55 microlitri di 10 kilodalton di Dextran AlexaFluor 488 soluzione madre su un pezzo di pellicola sigillante, quindi aggiungere 55 microlitri di tre kilodalton di Dextran Texas Red soluzione stock. Mescolare e raccogliere 100 microlitri in una siringa fine monouso.

Quindi, posizionare un mouse anestetizzato in posizione laterale sul tavolo. Iniettare per via endovenosa 100 microlitri di traccianti fluorescenti nel topo prima che il topo si svegli. Lasciare circolare il tracciante per 15 minuti.