JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:46 min. • July 8th, 2025
Eseguire criosezioni di tessuti craniofacciali embrionali di topo fissati comprendenti cellule della cresta neurale.
Lavare le sezioni in un tampone contenente un detergente non ionico per rimuovere il mezzo di inclusione e permeabilizzare le membrane, consentendo l'accesso ai bersagli intracellulari.
Aggiungere una soluzione bloccante per saturare i siti di legame non specifici.
Rimuovere la soluzione bloccante in eccesso. Quindi, incubare con anticorpi primari mirati agli antigeni nucleari, come fattori di trascrizione e marcatori di proliferazione.
Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.
Incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorofori per legarsi agli anticorpi primari legati all'antigene.
Rimuovere gli anticorpi non legati utilizzando il tampone.
Aggiungere un mezzo anti-sbiadimento con un colorante nucleare fluorescente e coprire con un vetrino coprioggetti.
Il colorante colora i nuclei e il mezzo anti-sbiadimento protegge i segnali fluorescenti durante l'imaging.
Visualizzare le sezioni al microscopio a fluorescenza per valutare l'espressione e la localizzazione dei marcatori nucleari, indicando la proliferazione delle cellule della cresta neurale e l'attività di segnalazione.
Sciacquare i vetrini in PBST allo 0,1% tre volte per cinque minuti ciascuno, per lavare l'OCT e permeabilizzare le sezioni. Aggiungere 200 microlitri di soluzione bloccante a ciascun vetrino e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, rimuovere la soluzione bloccante senza risciacquare il vetrino. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo primario diluito in soluzione bloccante a ciascun vetrino e incubare per una notte a 4 gradi Celsius.
Sciacquare i vetrini con PBS tre volte per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Risciacquare in PBS tre volte per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente, sempre al riparo dalla luce. Per montare i vetrini, aggiungere due gocce di mezzo anti-sbiadimento con DAPI su ogni vetrino. Coprire con un vetrino coprioggetti e conservare a 4 gradi Celsius fino al momento dell'immagine.