Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare gli RNA messaggeri nei singoli neuroni. Ciò si ottiene mediante il patch clamping e la registrazione dei singoli neuroni, quindi aspirano completamente il citoplasma da ciascun neurone registrato dal Mr.mRNA e dal citoplasma. Il CD NA viene prodotto e amplificato mediante PCR.

In definitiva, mRNA specifici per recettori, canali ionici ed enzimi possono essere rilevati attraverso un sistema di imaging su gel convenzionale. Il mio nome è e lavoro presso l'Health Science Center dell'Università del Tennessee. In generale, gli individui che sono nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché la quantità di risonanze magnetiche in un singolo neuro è estremamente piccola e si perde facilmente.

Inizia questo protocollo utilizzando un vibratore per tagliare fette di cervello coronale spesse 300 micrometri contenenti la parte rostrale media del nigra sostanziale. I cervelli possono essere isolati da ratti spra dolly di 15-40 giorni. La procedura di taglio delle fette viene eseguita a freddo ghiacciato in una soluzione di taglio ad alto contenuto di saccarosio, ossigenata con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica e, a un pH di 7,4, incubare le fette nel liquido cerebrospinale artificiale e gorgogliare con un gas al 5% di anidride carbonica e al 95% di ossigeno.

Mantieni la temperatura a 34 gradi Celsius e lascia le fette lì per 45 minuti. Quindi mantieni le fette di cervello a temperatura ambiente fino alla registrazione. Inizia trasferendo una fetta di cervello in una camera di registrazione patch clamp.

Perfuso continuamente con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato a 32 gradi Celsius. Riempire le pipette dei cerotti con una soluzione intracellulare per autoclave preparata con acqua priva di DNA e RNA. Immergere una pipetta carica nella vasca.

Verificare che la resistenza sia compresa tra due e tre mega ohm. In primo luogo, localizzare la nigra sostanziale in base alla sua posizione distinta e anatomica. Quindi, utilizzando l'ottica namar e un obiettivo 60x, selezionare le celle di grandi dimensioni nel SNC e nell'SNR per la registrazione.

Questi sono possibili neuroni dopaminergici o GABAergici senza esitazione. Utilizzare una configurazione convenzionale di celle a tenuta stagna giga per creare una pinza amperometrica e una pinza di tensione. Queste registrazioni generalmente devono essere eseguite in meno di cinque minuti per ridurre al minimo la degradazione dell'mRNA.

In circa un minuto, è possibile fornire impronte elettrofisiologiche per i neuroni di interesse registrando solo le loro proprietà di membrana e di spiking. Dopo aver ottenuto i dati da un neurone di interesse, utilizzare una leggera aspirazione della bocca per aspirare il citoplasma. La guarnizione ermetica non deve essere rotta in caso contrario.

I detriti extracellulari, incluso l'mRNA, possono essere aspirati nella pipetta del cerotto e contaminare il contenuto cellulare. Espellere il contenuto cellulare in una provetta PCR da 0,2 millilitri rompendo il puntale della pipetta e applicando una leggera pressione positiva. Al termine, posizionare immediatamente la provetta in un congelatore negativo 20 per escludere la contaminazione di detriti extracellulari che possono contenere mRNA.

Effettuare un controllo negativo raccogliendo il contenuto di una pipetta a cerotti calata nel tessuto senza utilizzare alcuna aspirazione. Dopo aver raccolto il contenuto cellulare da 10 a 20 neuroni, inizia immediatamente la reazione di trascrizione inversa. Per ridurre al minimo la degradazione degli mRNA, iniziare digerendo qualsiasi DNA genomico contaminante con il DNA, uno per cinque minuti, a 25 gradi Celsius.

Questo passaggio è fondamentale per ridurre i potenziali falsi positivi e non deve essere eluso. Quindi inattivare quello del DNA con 1,2 microlitri di EDTA da 25 millimolari e incubare i campioni a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Ora, utilizza un kit disponibile in commercio per sintetizzare il CD NA per verificare che il DNA genomico sia stato completamente rimosso.

Eseguire una reazione di controllo di ciascun campione senza trascrittasi inversa. Mentre tutti gli altri componenti di reazione rimangono gli stessi. Conservare i prodotti a meno 20 gradi Celsius fino a quando non sono necessari per la progettazione della PCR.

I primer secondo le sequenze nella banca Gen, quando possibile, fanno l'introduzione di T che abbraccia le riparazioni primarie per aiutare a rilevare la contaminazione del DNA genomico. Per verificare l'efficacia delle coppie di primer, testarle su tutto il cervello CD NA per il primo stadio. La PCR amplifica cinque microlitri dei CDNA da 30 microlitri per 35 cicli utilizzando un protocollo standard di cicli termici.

Per il secondo stadio, la PCR amplifica un microlitro di prodotto PCR del primo stadio con la stessa riparazione primaria e utilizza un profilo ciclico leggermente modificato. Ora separare i prodotti su un gel AGROS al 2,5% e visualizzarli utilizzando AUM bromuro o gel verde. Sotto la luce UV, asportare le bande di DNA positive e sequenziarle utilizzando un kit disponibile in commercio per raccogliere il DNA.

Sono state confrontate le caratteristiche elettrofisiologiche dei neuroni nella nigra, nella pars, nella compacta e nella pars reticulata. I neuroni GABAergici SNR hanno mostrato una frequenza più elevata, un picco spontaneo a circa 10 hertz. I picchi avevano una durata di base di circa un millisecondo dopo l'iniezione di corrente iperpolarizzante.

I neuroni GABAergici SNR hanno mostrato una sottile risposta SAG che indica una corrente attivata settimanalmente. Al contrario, i neuroni nigrodopaminergici hanno mostrato picchi spontanei a bassa frequenza con una durata di base di circa tre millisecondi. I neuroni dopaminergici hanno anche mostrato un SAG pronunciato in risposta all'iperpolarizzazione, indicando una forte espressione della corrente IH nei neuroni GABAergici SNR, ma non nei neuroni dopaminergici.

La singola cellula R-T-P-C-R ha rilevato l'mRNA per la decarbossilasi dell'acido glutammico uno, un enzima chiave nella sintesi del GABA. Al contrario, un ha identificato i neuroni dopaminergici SNC e SNR, ma non nei neuroni GABAergici. La singola cellula R-T-P-C-R ha rilevato l'mRNA per la tirosina idrossilasi, un enzima chiave per la sintesi della dopamina.

Successivamente, la singola cella R-T-P-C-R è stata utilizzata per profilare l'espressione delle subunità a tre canali KV attivate dalla tensione, che variano le proprietà dei canali del potassio voltaggio-dipendenti. Nell'esempio SNR gaba, gli mRNA dei neuroni per KV 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 sono stati rilevati solo in un esempio di neurone S-N-R-D-A. KV 3.2, 3.3 e 3.4 sono stati rilevati nei dati aggregati.

KV 3.1 è stato rilevato più frequentemente nei neuroni SNR GABAergici che nei neuroni nigro dopaminergici, indicando un livello di espressione più elevato di KV 3.1 nei neuroni GABA SNR vichinghi veloci. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di indossare i guanti e mantenere gli strumenti liberi dalla scienza dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare l'espressione e la funzione dei recettori e dei canali ionici nel sistema nervoso.