Marcatura mediata da virus e trapianto di cellule di eminenza gangliare mediale per studi in vivo

Raccogliere il tessuto di eminenza gangliare mediale, contenente progenitori interneuroni corticali, da embrioni di topo geneticamente modificati.

Aggiungere un polimero cationico e dissociare il tessuto in una sospensione unicellulare.

Aggiungere vettori lentivirali che trasportano un reporter GFP Cre ricombinasi-dipendente affiancato da siti lox. Incubare.

Il polimero neutralizza le cariche della membrana virale e della cellula ospite, consentendo la fusione virale e il rilascio di RNA.

L'RNA virale viene trascritto inversamente e integrato nel genoma ospite.

Centrifugare ed eliminare il surnatante. Assorbire il fluido in eccesso.

Trasferire le cellule su una superficie idrofoba e caricarle in un dispositivo di iniezione.

Iniettare le cellule nella corteccia di un cucciolo di topo anestetizzato.

Lascia che il cucciolo si riprenda e cresca.

I progenitori trapiantati si differenziano in interneuroni maturi nella corteccia.

Un sottogruppo di questi interneuroni co-esprime Cre ricombinasi e RFP.

In questi interneuroni, Cre asporta i siti lox, capovolgendo il gene GFP e consentendone l'espressione.

Visualizzare la co-espressione di RFP e GFP per identificare gli interneuroni che esprimono Cre.

Dopo aver preparato il lentivirus e sezionato l'MGE secondo le indicazioni del protocollo scritto, raccogliere entrambi gli emisferi dell'MGE e mettere il tessuto in due provette di raccolta da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di DMEM con il 10% di FBS.

Conservare i campioni sul ghiaccio fino a quando tutto il tessuto non è stato raccolto. Quindi trasferire i tubi in una cappa certificata BSL-2. Aspirare con cura il terreno senza disturbare i tessuti MGE depositati sul fondo della provetta.

Quindi aggiungere circa 500 microlitri di DMEM preriscaldato con il 10% di materiale FBS. Aggiungere il polibrene a una concentrazione finale di 8 microgrammi per millilitro e titolare attraverso un puntale per pipetta P1000 fino a ottenere una sospensione a singola cellula. Quindi, aggiungere da 15 a 20 microlitri di lentivirus concentrato in ogni provetta.

Quindi, chiudere saldamente ogni tubo, capovolgerlo per mescolare, quindi posizionare tutti i tubi in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Incubare le cellule con il lentivirus per almeno 30 minuti, ma non più di un'ora, poiché tempi più lunghi hanno comportato una diminuzione della vitalità cellulare. Capovolgere i tubi ogni 10 minuti.

Dopo l'incubazione, rimuovere le provette dall'incubatore e centrifugare a 700 volte g a 4 gradi Celsius per tre minuti per pellettare le cellule. Nella cappa BSL-2, rimuovere il surnatante e gettarlo in candeggina al 10%. Successivamente, aggiungere 1 millilitro di DMEM con il 10% di FBS e titolare il pellet due o tre volte per lavarlo.

Dopo la centrifugazione come prima, ripetere questo passaggio di lavaggio altre due o tre volte per rimuovere il virus in eccesso. Dopo il lavaggio finale, rimuovere quanto più terreno possibile e mettere ogni tubo sul ghiaccio.

A causa del terreno residuo sui lati del tubo, circa 2 o 3 microlitri di terreno finiranno per coprire il pellet cellulare, quando la procedura di trapianto è iniziata. Assicurandosi che la tecnica sterile venga utilizzata per tutto il tempo, aspirare l'olio minerale in una siringa da 1 millilitro, quindi con un ago da 30,5 gauge, riempire completamente la pipetta di vetro con l'olio minerale.

Quindi, collegare la pipetta di vetro al dispositivo stereotassico e caricarla sullo stantuffo. Con un assistente che utilizza l'azionamento idraulico, spostare lo stantuffo di circa metà nella pipetta di vetro, rimuovendo l'olio minerale che fuoriesce con un tovagliolo di carta pulito.

Quindi, attorcigliare l'angolo di un tovagliolo di carta sterile in una punta sottile e utilizzarlo per rimuovere delicatamente il terreno in eccesso sopra il pellet di cellule MGE. In questo modo si concentrerà la densità cellulare in modo da ottenere volumi di iniezione più piccoli.

Quindi, utilizzare una pipetta P2 per aspirare lentamente il pellet cellulare e titolarlo una o due volte prima di erogarlo su una superficie idrofoba. Il volume dovrebbe essere di poco inferiore a 1 microlitro.

Spostare la punta dell'ago nella sospensione cellulare e, utilizzando l'azionamento idraulico, aspirare la sospensione cellulare nella pipetta. Dopo aver anestetizzato un cucciolo tramite ipotermia, verifica l'efficacia dell'anestesia pizzicando la pelle tra le dita dei piedi con una pinza. Non si dovrebbe vedere alcuna reazione.

Quindi, posiziona il cucciolo su uno stampo che si trova sotto il dispositivo di iniezione e rendi la pelle tesa tirando indietro la pelle sulla testa e poi fissandola con del nastro da laboratorio standard. Lavorando rapidamente, manipolare il braccio stereotassico per posizionare la punta della pipetta di vetro sulla testa del cucciolo, perpendicolare alla superficie della testa.

Quando la pipetta è a contatto con la testa, considerare questo valore uno zero. Quindi, spingere la pipetta attraverso la superficie della pelle e del cranio nella corteccia. Quindi, inserire e ritrarre la pipetta due volte prima di fermarla.

Per il targeting delle cellule nella neocorteccia, le iniezioni vengono eseguite quando la micropipetta si trova a una profondità di 0,1 millimetri. Una volta che l'ago è in posizione, ruotare il dispositivo idraulico per far avanzare lo stantuffo nella pipetta di vetro e iniettare da 50 a 70 nanolitri per sito.

Ripetere questa procedura in tre-sei siti diversi a diversi livelli rostrale-caudali se è necessaria un'ampia distribuzione di cellule trasformate in tutta la neocorteccia. Al termine delle iniezioni, rimuovere il cucciolo dal palco e contrassegnarlo secondo le procedure approvate.

Una volta che il cucciolo si è ripreso ed è in grado di muoversi da solo, rimettilo con la femmina in allattamento e il resto della cucciolata. Controlla i cuccioli dopo la procedura e il giorno successivo, per assicurarti che non ci siano segni di deterioramento della salute.