Colorazione in immunofluorescenza del cervello di Drosophila per l'imaging di cellule gliali a singola cellula

Inizia con il cervello delle mosche transgeniche Drosophila, contenenti diversi tipi di cellule gliali che ospitano un sistema ricombinasi specifico per le cellule.

Determina l'espressione di una proteina della superficie cellulare fusa a diversi epitopi antigenici sullo stesso tipo di cellule.

Trattare il tessuto con un fissativo per reticolare le proteine e preservare l'architettura tissutale.

Lavare per rimuovere il fissativo in eccesso.

Aggiungere proteine bloccanti per mascherare i siti di legame non specifici per ridurre la colorazione di fondo.

Incubare il tessuto con un cocktail di anticorpi primari che si lega ai diversi epitopi espressi sulle cellule gliali.

Lavare per rimuovere gli anticorpi primari non legati.

Incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorofori che si legano agli anticorpi primari.

Lavare per rimuovere gli anticorpi secondari non legati.

Monta il cervello all'interno di un distanziatore di imaging e posiziona un vetrino coprioggetti. Il distanziatore crea una camera per il tessuto, preservandone la struttura tridimensionale.

Cellule diverse dello stesso tipo gliale marcate con diversi anticorpi coniugati con fluorofori consentono di comprendere le interazioni cellula-cellula.

Trasferire i cervelli isolati utilizzando un puntale per pipetta P10 in una provetta da microcentrifuga da 200 microlitri con soluzione fissativa. Non maneggiare mai il cervello usando il forcipe. Incubare i tessuti al riparo dalla luce. Evitare di aspirare il cervello durante i trasferimenti della soluzione.

Per rimuovere il fissativo, utilizzare tre o più lavaggi di 15 minuti con soluzione di lavaggio. Quindi, bloccare i tessuti con una soluzione bloccante per 30 minuti o più. Successivamente, sostituire la soluzione bloccante con anticorpi primari diluiti in soluzione di lavaggio e incubare il cervello durante la notte a 4 gradi Celsius.

Per rimuovere gli anticorpi primari, utilizzare tre lavaggi di 1 ora in soluzione di lavaggio. Successivamente, aggiungere anticorpi coniugati con fluorofori secondari in soluzione di lavaggio e incubare il cervello per una notte a 4 gradi Celsius o per 4 ore a temperatura ambiente. Per eliminare completamente gli anticorpi non legati, utilizzare tre lavaggi di 1 ora in soluzione di lavaggio, seguiti da un lavaggio più lungo con PBS.

Quindi, monta il cervello. Preparare due vetrini coprioggetti con un distanziatore per immagini. Nel distanziatore e sul vetrino coprioggetti extra, applicare 10 microlitri di terreno di montaggio con un agente anti-sbiadimento. Successivamente, utilizzando una pipetta P10, trasferire i cervelli sul vetrino coprioggetti, depositandoli accanto al terreno insieme a un po' di PBS. Non lasciare che il fazzoletto si asciughi.

Ora, spostare con cautela i cervelli nel mezzo di montaggio, utilizzando la pipetta. E infine, spostali al mezzo nel distanziatore e disponili con una pinza. Quindi, rimuovere il rivestimento adesivo sui distanziatori e applicare un vetrino coprioggetti. Fissare il vetrino coprioggetti con una leggera pressione utilizzando una pinza e procedere immediatamente con l'imaging.