Name: Aumentare le rese cDNA da singola cellula quantità di mRNA nelle reazioni standard di laboratorio della trascrittasi inversa utilizzando Microstreaming acustico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Scopri come aumentare la resa di cDNA da mRNA a singola cellula utilizzando un micromixer con microstreaming acustico nelle reazioni di trascrittasi inversa standard. Questo metodo migliora l'analisi dell'espressione genica.

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Questo studio è stato sostenuto dal National Health and Medical Research Council of Australia (progetto non concede. 6.288.480) e il Scobie e Chiara MacKinnon Trust.

1. Micromixing una reazione RT <ol><li> Prima di eseguire una reazione RT con micromixing, equilibrare la micromixer alla temperatura desiderata della reazione RT. <ol><li> Posizionare il micromixer all'interno di un 37 ° C (o la temperatura consigliata dal fornitore RT) incubatore per almeno 1 ora prima dell'inizio della reazione RT. </li></ol></li><li> Impostare il mix RT secondo il fornitore di trascrittasi inversa (ad esempio MMTV-RT da Promega, Omniscript da Qiagen) le istruzioni, tranne l'uso di singole cellule quantità di RNA totale di ingresso (per esempio 0.1-1pg/μl), invece del-ng mg quantità raccomandate dai fornitori. <ol><li> Noi uso standard sterile, priva di nucleasi 200μL tubi con pareti sottili PCR. </li></ol></li><li> Posizione tubi RT saldamente il micromixer non appena sono pronti per la miscelazione. Il micromixer deve rimanere all'interno della 37 ° C incubatore per tutta la durata della reazione RT. </li><li> Selezionare la corretta frequenza e l'ampiezza di micromixing. In questo esempio si usa 150Hz. </li><li> Accendere il micromixer su e lasciarlo acceso per tutta la durata della reazione RT (60 minuti). </li><li> Accendere il micromixer fuori e prendere i tubi RT una volta la reazione di RT è completa. </li><li> Posizionare i tubi RT su ghiaccio e procedere come di consueto con ulteriori applicazioni quali quantitativa reazione a catena della polimerasi (qPCR o real-time PCR). </li></ol> 2. Rappresentante dei risultati: Il vantaggio di micromixing nel contesto di reazioni RT è un aumento della resa del DNA rispetto a quando altri metodi di miscelazione (es. agitazione, vortex o triturazione) sono utilizzati. Questo può essere visto, per esempio, su successiva analisi del cDNA Reazione a catena della polimerasi utilizzando quantitativa (qPCR o real-time PCR). Figura 2A illustra gli effetti di micromixing per i primi 5 minuti (blu, "micromixed5") o l'intero 60 minuti (rosso, "micromixed60") rispetto a triturazione della reazione RT immediatamente prima della incubazione RT (nero, "triturazione" ). In questo caso il volume della reazione precedente RT era 25μL e conteneva 2.5pg di RNA totale. tracce qPCR utilizzando primers progettati per rilevare cDNA che rappresentano Nurr-1 mRNA sono indicati sopra, e la media ± SEM del numero di cicli per raggiungere fluorescenza massimo del 50% in 3 ripetizioni di questo stesso esperimento sono tracciate di seguito. L'asterisco indica una differenza statisticamente significativa (ANOVA a una via con Tukey confronti multipli). Si noti che micromixing per i primi 5 minuti della reazione precedente RT ha prodotto una non significativa miglioramento rispetto triturazione micromixing mentre per l'intero 60 minuti di reazione RT precedente ha prodotto un miglioramento significativo rispetto triturazione, la cui entità è stata pari a circa 15 qPCR cicli, in media. Il vantaggio di micromixing può essere visto anche in curva di fusione analisi dei prodotti qPCR successive ottenuti. Nell'esperimento illustrato nella figura 2B, micromixing per l'intero 60 minuti di reazione precedente RT portato ad un segnale qPCR consistente in campioni di duplicato (Figura 2BA, 2 tracce di rosso), mentre micromixing per i primi 5 minuti o triturazione prodotto solo qPCR incoerente tracce (Figura 2BA, 2 tracce blu e 2 tracce nere, rispettivamente). Le tracce grigio sono controlli negativi ("neg.") In cui cDNA è stato lasciato fuori della reazione qPCR. Quando i prodotti qPCR da questo esperimento sono state denaturate dal rampa loro temperatura (analisi di fusione cioè curva) era evidente che determinati prodotti PCR (cioè un amplicone che era identica a quella ottenuta quando le concentrazioni molto più elevato di mRNA sono stati trascrizione inversa e amplificata da qPCR, dati non riportati) erano presenti solo le seguenti reazioni RT che erano stati micromixed per 60 minuti (Figura 2Bb, 2 tracce di rosso). Tutti gli altri (cioè micromixed5, triturazione e controlli negativi) di produzione di beni amplicone alternative (ad esempio dimeri primer). <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo per l'applicazione di standard di laboratorio micromixing reazioni RT. Descrizioni più dettagliate del principio fisico coinvolto, la micromixer e come costruire un in-house micromixer sono forniti riferimenti 13,14 <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rappresentante dati qPCR illustrando i vantaggi della micromixing applicata al precedente reazioni RT composto da singole cellule quantità di mRNA in altro modo standard di laboratorio reazioni RT. Un esempio tracce qPCR rilevazione del DNA mRNA rappresenta la codifica Nurr-1 gene. Le reazioni precedente RT contenute 2.5pg di RNA totale in un volume di 25μL e sono stati eseguiti in un incubatore a 37 ° C per 60 minuti. Reazioni RT sono state remixate da triturazione del RT mix prima di incubazione (tracce nere, "triturazione"), micromixed durante i primi 5 minuti della reazione RT (tracce blu, "micromixed5") o micromixed per l'intero 60 minuti di reazione RT (tracce rosse, "micromixed60" ). Media ± SEM del numero di cicli necessari per raggiungere qPCR fluorescenza massimo del 50% sono riportati qui di seguito per n = 3 ripetizioni di questo esperimento. Asterisco indica una differenza significativa (ANOVA a una via con Tukey confronti multipli). B Un altro esperimento qPCR esaminando Nurr-1 prodotto cDNA, questa volta a seguito di reazioni RT contenente 25pg di RNA totale in un volume di 25μL. tracce qPCR (a), così come l'analisi della curva di fusione dei prodotti qPCR ottenuti (b) sono indicati per le diverse condizioni di miscelazione. Controlli negativi in ​​cui è stato inserito nessun cDNA nella reazione precedente RT sono inclusi anche (tracce grigie, "neg."). Reazioni RT con concentrazioni molto più elevate di mRNA sono stati eseguiti e prodotti picchi curva di fusione (dati non riportati) identici a quelli (b) per micromixed60 (tracce rosse) campioni.

<ol><li>Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Funct+Genomic+Proteomic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Brief Funct Genomic Proteomic.</a> 2 (1), 31-31 (2003).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo di applicazione della micromixing a standard di laboratorio reazioni RT qui descritto può, ovviamente, coinvolgere mRNA raccolte attraverso qualsiasi mezzo (ad esempio la lisi cellulare, microdissezione laser cattura). Si può altresì comprendere qualsiasi marca o tipi di reagenti RT, qualsiasi temperatura (entro la tolleranza dei materiali della micromixer), e qualsiasi periodo di tempo. Per esempio, abbiamo osservato una migliore resa del DNA da reazioni di RT che comprende casuale esamero o oligo-dT primer. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> RNA totale è stato isolato da scatto fette surgelati del mouse acutamente preparato adulti mesencefalo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PicoPure RNA Isolation Kit </td><td> Arturo, CA, USA </td><td> KIT0204 </td><td> Il kit è ora disponibile da Applied Biosystems </td></tr><tr><td> DNA-free DNasi trattamento e reagenti di rimozione </td><td> Ambion </td><td> AM1906M </td><td></td></tr><tr><td> Casuale esamero primer </td><td> Promega </td><td> C1181 </td><td></td></tr><tr><td> AMV-RT </td><td> Promega </td><td> M5101 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP set </td><td> Promega </td><td> U1240 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin Inibitore di ribonucleasi </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> Promega </td><td> P1193 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Verde PCR Master Mix </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4309155 </td><td></td></tr><tr><td> HPRT in avanti (20mer): CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hprt inversa (20mer): TAT GTC CCC CGT TGA CTG A </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 avanti (23mer): CAG CTC CGA CTT TTT AAC TCC AG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 inversa (23mer): GGT GAG GTC CGT CAT AAA CTT GA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Spettrofotometro. </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Corbett Rotor Gene RG-6000 </td><td> Corbett Life Science </td><td></td><td> Corbett Life Science è stata acquisita da QIAGEN nel luglio 2008 </td></tr></tbody></table>

aumentare le rese cdna da singola cellula quantità di mrna nelle reazioni standard di laboratorio della trascrittasi inversa utilizzando microstreaming acustico

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

L&#39;espressione genica correlazione con il comportamento delle cellule è idealmente fatto a livello di singola cellula. Tuttavia, questo non è facilmente ottenibile, perché la piccola quantità di mRNA labili presenti in una singola cella (1-5% di 1-50pg RNA totale, o 0,01 2.5pg mRNA, per cella 1) degrada soprattutto prima di poter essere trascrizione inversa in una copia stabile cDNA. Ad esempio, utilizzando reagenti di laboratorio e hardware standard, solo un piccolo numero di geni possono essere qualitativamente valutati per cella 2. Un modo per aumentare l&#39;efficienza dello standard di laboratorio della trascrittasi inversa (RT) reazioni (reagenti standard, cioè in volumi microlitri) comprendente cella singola quantità di mRNA potrebbe essere quella di mescolare più rapidamente i reagenti in modo che il mRNA può essere convertito in cDNA prima che degrada. Tuttavia questo non è banale perché a scale microlitro flusso del liquido è laminare, cioè i metodi attualmente disponibili di miscelazione (es. agitazione, vortex e triturazione) non riescono a produrre sufficiente moto caotico di mescolare in modo efficace i reagenti. Per risolvere questo problema, le tecniche di miscelazione micro-scala devono essere utilizzati 3,4. Un certo numero di tecnologie di miscelazione microfluidica a base sono state sviluppate con successo che aumentare le rese di reazione RT 5-8. Tuttavia, le tecnologie microfluidica richiedono hardware specializzato che è relativamente costoso e non ancora ampiamente disponibili. Una soluzione più economica, più conveniente è auspicabile. L&#39;obiettivo principale di questo studio è di dimostrare come l&#39;applicazione di una nuova tecnica &quot;micromixing&quot; per standard di laboratorio reazioni RT composto da singole cellule quantità di mRNA aumenta significativamente il loro rendimento cDNA. Troviamo rendimenti cDNA aumentare di circa 10 100 volte, che consente: (1) maggior numero di geni da analizzare per cella, (2) un&#39;analisi più quantitativa di espressione genica, e (3) rilevazione migliore di bassa abbondanza geni in singole cellule. Il micromixing si basa su acustica microstreaming 9-12, un fenomeno in cui le onde sonore di propagazione intorno ad un piccolo ostacolo creare un flusso medio vicino l&#39;ostacolo. Abbiamo sviluppato un acustico microstreaming dispositivo basato su (&quot;micromixer&quot;) con una semplificazione chiave; microstreaming acustico può essere ottenuto a frequenze audio, garantendo che il sistema è un liquido-aria con un piccolo raggio di curvatura 13. Il menisco di un volume microlitri di soluzione in un tubo fornisce un adeguato raggio di curvatura piccolo. L&#39;uso delle frequenze audio significa che l&#39;hardware può essere poco costoso e versatile 13, e gli acidi nucleici e di altri reagenti biochimici non sono danneggiati come possono essere con sonicatori standard di laboratorio.

Descriviamo un nuovo metodo per aumentare la resa cDNA da singole cellule quantità di mRNA nelle reazioni inverso altrimenti standard di laboratorio trascrizione. La novità risiede nell&#39;utilizzo di un micromixer, che utilizza il fenomeno della microstreaming acustico, di mescolare i fluidi a scale microlitro più efficacemente di agitazione, vortex o triturazione.

Aumentare le rese cDNA da singola cellula quantità di mRNA nelle reazioni standard di laboratorio della trascrittasi inversa utilizzando Microstreaming acustico

La correlazione tra l'espressione genica e il comportamento cellulare viene idealmente eseguita a livello di singola cellula. Tuttavia, ciò non è facilmente realizzabile a causa della ridotta quantità di...

Questa procedura aumenta i rendimenti di CD NA a partire da quantità di mRNA di singola cellula. Iniziare equilibrando il micromiscelatore all'interno di un incubatore impostato alla temperatura desiderata per la reazione di trascrizione inversa. Preparare quindi reazioni di RT di laboratorio standard, costituite da quantità di RNA di singola cellula in volumi microlitrici.Posizionare in modo sicuro il tubo della reazione nei fori del mescolatore, selezionando i parametri di miscelazione appropriati e accendere il micromiscelatore. In definitiva, questa procedura può essere utilizzata per ottenere rese aumentate di CDNA mediante PCR quantitativa come preparazione per la reazione di RT. Portare in equilibrio il micromiscelatore in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno un'ora.In provette PCR sterili standard senza nucleasi da 200 microlitri a pareti sottili. Impostare le reazioni di trascrittasi inversa secondo le istruzioni del fornitore, ma utilizzare quantità da singola cellula di RNA totale in ingresso. Selezionare ora la frequenza e l'ampiezza appropriate della micromiscelazione.Posizionare successivamente il tubo in modo sicuro nel micromixer. Quindi accendere il micromixer. Lasciare procedere la reazione per 60 minuti; al termine, spegnere il micromixer e trasferire le reazioni sul ghiaccio per un uso immediato nelle successive applicazioni a valle. Rispetto ad altri metodi, il vantaggio principale del micromixing nel contesto delle reazioni di RT è il rendimento di acido nucleico complementare (CD NA).In questa analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa, i tracciati QPCR ottenuti utilizzando primers progettati per rilevare il cDNA corrispondente all'mRNA di neuro one illustrano gli effetti del microm miscelamento nei primi cinque minuti o nell'intero periodo di 60 minuti, confrontati con la durata della reazione di RT immediatamente precedente all'incubazione di RT. Il microm miscelamento nei primi cinque minuti non ha determinato un miglioramento significativo rispetto alla condizione di non miscelamento. Tuttavia, il microm miscelamento per l'intero periodo di 60 minuti ha prodotto un miglioramento significativo del rendimento, equivalente a 15 cicli QPCR.Inoltre, l'analisi della curva di denaturazione della QPCR dimostra che un mescolamento micro per l'intero periodo di 60 minuti della precedente reazione R due produce un segnale costante in campioni duplicati, come mostrato dalle tracce rosse. Questo risultato contrasta con le tracce variabili osservate con il mescolamento micro per i primi cinque minuti, mostrate in blu, o con l'aggiunta di solo tampone, mostrate in grigio scuro; le tracce nere rappresentano i controlli senza stampo.

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Scopri come aumentare la resa di cDNA da mRNA a singola cellula utilizzando un micromixer con microstreaming acustico nelle reazioni di trascrittasi inversa standard. Questo metodo migliora l'analisi dell'espressione genica.

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Aumentare le rese cDNA da singola cellula quantità di mRNA nelle reazioni standard di laboratorio della trascrittasi inversa utilizzando Microstreaming acustico

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