Aumentare le rese cDNA da singola cellula quantità di mRNA nelle reazioni standard di laboratorio della trascrittasi inversa utilizzando Microstreaming acustico
11 luglio 2011
Descriviamo un nuovo metodo per aumentare la resa cDNA da singole cellule quantità di mRNA nelle reazioni inverso altrimenti standard di laboratorio trascrizione. La novità risiede nell'utilizzo di un micromixer, che utilizza il fenomeno della microstreaming acustico, di mescolare i fluidi a scale microlitro più efficacemente di agitazione, vortex o triturazione.
Questa procedura aumenta i rendimenti di CD NA a partire da quantità di mRNA di singola cellula. Iniziare equilibrando il micromiscelatore all'interno di un incubatore impostato alla temperatura desiderata per la reazione di trascrizione inversa. Preparare quindi reazioni di RT di laboratorio standard, costituite da quantità di RNA di singola cellula in volumi microlitrici.
Posizionare in modo sicuro il tubo della reazione nei fori del mescolatore, selezionando i parametri di miscelazione appropriati e accendere il micromiscelatore. In definitiva, questa procedura può essere utilizzata per ottenere rese aumentate di CDNA mediante PCR quantitativa come preparazione per la reazione di RT. Portare in equilibrio il micromiscelatore in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno un'ora.
In provette PCR sterili standard senza nucleasi da 200 microlitri a pareti sottili. Impostare le reazioni di trascrittasi inversa secondo le istruzioni del fornitore, ma utilizzare quantità da singola cellula di RNA totale in ingresso. Selezionare ora la frequenza e l'ampiezza appropriate della micromiscelazione.
Posizionare successivamente il tubo in modo sicuro nel micromixer. Quindi accendere il micromixer. Lasciare procedere la reazione per 60 minuti; al termine, spegnere il micromixer e trasferire le reazioni sul ghiaccio per un uso immediato nelle successive applicazioni a valle. Rispetto ad altri metodi, il vantaggio principale del micromixing nel contesto delle reazioni di RT è il rendimento di acido nucleico complementare (CD NA).
In questa analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa, i tracciati QPCR ottenuti utilizzando primers progettati per rilevare il cDNA corrispondente all'mRNA di neuro one illustrano gli effetti del microm miscelamento nei primi cinque minuti o nell'intero periodo di 60 minuti, confrontati con la durata della reazione di RT immediatamente precedente all'incubazione di RT. Il microm miscelamento nei primi cinque minuti non ha determinato un miglioramento significativo rispetto alla condizione di non miscelamento. Tuttavia, il microm miscelamento per l'intero periodo di 60 minuti ha prodotto un miglioramento significativo del rendimento, equivalente a 15 cicli QPCR.
Inoltre, l'analisi della curva di denaturazione della QPCR dimostra che un mescolamento micro per l'intero periodo di 60 minuti della precedente reazione R due produce un segnale costante in campioni duplicati, come mostrato dalle tracce rosse. Questo risultato contrasta con le tracce variabili osservate con il mescolamento micro per i primi cinque minuti, mostrate in blu, o con l'aggiunta di solo tampone, mostrate in grigio scuro; le tracce nere rappresentano i controlli senza stampo.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo per aumentare il rendimento di cDNA dall'mRNA di singole cellule utilizzando un micromixer. La tecnica sfrutta il microflusso acustico per migliorare la miscelazione dei fluidi nelle reazioni standard di trascrizione inversa.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biotecnologia
- Genomica
Sfondo
- La sintesi del cDNA è fondamentale per l'analisi dell'espressione genica.
- L'analisi a singola cellula pone sfide in termini di resa di RNA.
- I metodi tradizionali di miscelazione possono risultare insufficienti per volumi ridotti.
- La microfluidica acustica offre una possibile soluzione per un migliore mescolamento.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per aumentare il rendimento di cDNA dall'mRNA di singola cellula.
- Utilizzare un micromixer per migliorare il mescolamento del fluido.
- Valutare l'efficacia di questo metodo nelle reazioni di RT standard.
Metodi Utilizzati
- Equilibrare il micromixer in un incubatore a 37°C.
- Impostare reazioni standard di trascrizione inversa con RNA da singola cellula.
- Posizionare le provette della reazione nel micromixer.
- Regolare i parametri di miscelazione e attivare il micromixer.
Risultati principali
- Sono stati osservati rendimenti maggiori di cDNA rispetto ai metodi tradizionali.
- Il micromiscelatore ha migliorato efficacemente la miscelazione su scala microlitro.
- I risultati della PCR quantitativa hanno confermato i rendimenti migliorati.
- Il metodo è applicabile a diverse analisi di RNA da singola cellula.
Conclusioni
- Il micromiscelatore offre un vantaggio significativo nella sintesi di cDNA da mRNA di singole cellule.
- Questo approccio può facilitare studi più accurati sull'espressione genica.
- Applicazioni future potrebbero includere analisi trascrittomiche più ampie a livello di singola cellula.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Migliorare il rendimento di cDNA dall'mRNA di singole cellule risolve un collo di bottiglia fondamentale nei flussi di lavoro di convalida degli target e di screening fenotipico. Permettendo l'analisi di un numero maggiore di geni per cellula con precisione quantitativa, questo metodo aumenta l'affidabilità predittiva nelle decisioni iniziali di scoperta. L'approccio favorisce la riduzione del rischio delle ipotesi terapeutiche grazie a letture molecolari riproducibili e scalabili ottenute da campioni biologici limitati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche aumentando il numero di geni rilevabili per singola cellula.
- Valore operativo: Riduce la variabilità tecnica nella conversione da mRNA a cDNA, migliorando la coerenza del saggio tra ripetizioni.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli attraverso un rilevamento più affidabile di trascritti a bassa abbondanza associati a meccanismi patologici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara librerie di cDNA validate per lo screening successivo, aumentando la sensibilità nell'identificazione dei risultati positivi.
- Valore operativo: Standardizza l'elaborazione dell'RNA in ingresso utilizzando attrezzature di laboratorio accessibili, migliorando la produttività.
- Valore della piattaforma: Compatibile con reagenti standard di RT e analisi qPCR, facilitando l'integrazione nei flussi di screening esistenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Consente la scoperta di biomarcatori da popolazioni cellulari rare migliorando i limiti di rilevamento per bersagli transitori o a bassa espressione.
- Valore operativo: Fornisce output quantitativi e riproducibili che favoriscono l'allineamento tra team di scoperta e preclinici.
- Contenimento del rischio: Riduce il rischio di falsi negativi nella validazione del bersaglio aumentando il rendimento di cDNA senza richiedere infrastrutture microfluidiche specializzate.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando in particolare il passaggio dalla generazione dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, migliorando la qualità e la quantità degli input molecolari per lo screening funzionale.
- Biologia della scoperta: Migliora la validazione degli obiettivi consentendo un profilo trascrizionale completo a partire da quantità di mRNA di singola cellula.
- Screening: Aumenta la prontezza del saggio grazie a un rendimento maggiore di cDNA, sostenendo la rilevazione di cambiamenti affidabili nell'espressione indotti da composti.
- Analisi: Produce output quantitativi compatibili con la qPCR che permettono il confronto statistico dell'espressione genica tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità con lavori preclinici consentendo la rilevazione di trascritti rilevanti per la malattia in campioni limitati di cellule primarie.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità scalabile e a basso costo applicabile a più progetti e sistemi modello senza richiedere piattaforme microfluidiche dedicate.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo il rumore tecnico nella sintesi di cDNA da input di RNA limitanti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro per l'espressione genica a singola cellula utilizzando apparecchiature di laboratorio standard.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione consentendo un profilo molecolare più completo per ogni campione, riducendo i falsi negativi biologici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta l'avanzamento con rischio aggiustato aumentando la fiducia nei dati di interazione con l'obiettivo e di modulazione del percorso derivati da analisi a singola cellula.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede familiarità con i principi dell'acoustic microstreaming e l'ottimizzazione dei parametri di frequenza e ampiezza per specifici volumi di reazione.
- Presuppone l'accesso a un incubatore con controllo della temperatura e a provette PCR a pareti sottili compatibili per una efficace formazione del menisco.
- Necessita della standardizzazione della durata del mescolamento e delle impostazioni di potenza tra diversi utilizzatori per garantire rese riproducibili di cDNA.
- Comporta la validazione dell'integrità degli acidi nucleici dopo il mescolamento per confermare l'assenza di degradazione dovuta a effetti meccanici o termici.
- È limitato ad applicazioni in cui l'aumento della resa di cDNA migliora direttamente la sensibilità analitica a valle, come nell'analisi mediante qPCR o nella preparazione di librerie per sequenziamento.
