Name: Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Scopri la separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica e RNA da comunità virali ambientali usando la cromatografia idrossiapatite. Questo metodo consente di studiare la diversità e il potenziale funzionale dei virus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questa ricerca è stata sostenuta dall&#39;Ufficio della Scienza (BER), US Department of Energy, Cooperativa accordo no. De-FC02-02ER63453, la National Science Foundation microbica Programma Genome Sequencing (numeri premio 0626826 e 0731916). Ringraziamo Giovanni in vetro per la sua competenza tecnica e di consulenza e K. Eric Wommack per la sua assistenza con la raccolta dei campioni ambientali.

1. Preparazione di soluzioni Prima di eseguire la cromatografia idrossiapatite, tamponi fosfato deve essere preparato e l'idrossiapatite devono essere adeguatamente idratati. <ol><li> Soluzione fosfato 1M, pH 6,8: In un pallone da 1 litro sciogliere 119.98g di fosfato monobasico di sodio in 1 litro di sterile, DEPC trattati con H 2 O. Preparare una soluzione 1M fosfato di sodio bibasico in un pallone da 1 litro, sciogliendo 141.96g di fosfato bibasico di sodio in 1 litro di sterile, DEPC trattati con H 2 O. Combinano la mono-e di soluzioni con un rapporto di 1:1. Pallone posto su un piatto mescolare e miscelare con una barra magnetica mescolare. Regolare il pH a 6,8 con l'aggiunta di idrossido di sodio (per aumentare il pH) o acido fosforico (per diminuire il pH). </li><li> Tampone fosfato 0.12M: in un pallone da 500 ml, unire 30 ml di soluzione 1M fosfato, pH 6,8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di EDTA 0.5M. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H2O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H2O a 250ml. Autoclave. </li><li> Tampone fosfato 0.18M: in un pallone da 500 ml, unire 45ml di soluzione 1M fosfato, pH 6,8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di EDTA 0.5M. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O a 250 ml. Autoclave. </li><li> Tampone fosfato 0.20m: in un pallone da 500 ml, unire 50 ml di soluzione 1M fosfato, pH 6,8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di EDTA 0.5M. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O a 250 ml. Autoclave. </li><li> Tampone fosfato 0,40 M: in un pallone da 500 ml, 100 ml di soluzione di combinare fosfato 1M, pH 6,8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di EDTA 0.5M. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O a 250 ml. Autoclave. </li><li> "1.00m fosfato buffer" (effettiva concentrazione di fosfato in questa soluzione è 0,91 M): in un pallone da 500 ml, unire 30 ml di soluzione di fosfato 1M, pH6.8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di 0.5M EDTA. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H2O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O a 250 ml. Autoclave. </li><li> Idratazione idrossiapatite: Peso da 1g di idrossiapatite e aggiungere in una provetta da 50 ml. Aggiungere 6 ml di tampone fosfato 0.12M al idrossiapatite e miscelare. Prima dell'uso portare la temperatura a 60 ° C e mescolare accuratamente. Conservare per lunghi periodi di tempo a 4 ° C. </li><li> Prima dell'uso, equilibrare tutti i tamponi fosfato e idrossiapatite idratata a 60 ° C. </li></ol> 2. Preparazione di Econo-Colonna <ol><li> Chiudere rubinetto. Sciacquare colonna parecchie volte con acqua deionizzata H 2 O invertendo ripetutamente la colonna e decantazione. </li><li> Rimuovere il rubinetto dal Econo-colonna e la colonna autoclave per la sterilizzazione. </li><li> Sostituire il rubinetto e chiudi. Aggiungere 1ml di Sigmacote alla sterile Econo-colonna e cappotto tutte le superfici in vetro. Aprire il rubinetto e decantare. </li><li> Allegare colonna a un bagno d'acqua circolante e impostare la temperatura a 60 ° C. Per einsure la minor quantità di perdita di calore attraverso la colonna avvolgendo la colonna in un agente isolanti come un foglio di alluminio o tubo di schiuma isolante è raccomandato. </li><li> Sciacquare la Econo-colonna due volte con sterili, RNasi-free H 2 O poi due volte con sterili, RNasi-free tampone fosfato 0.12M. </li></ol> 3. Hydroxypaptite cromatografia <ol><li> Assicurandosi che il rubinetto è chiuso, aggiungere lentamente 2 ml di pre-preparati, idrossiapatite risospese alla parte inferiore del Econo-colonna con una pipetta sterile 2ml sierologici. </li><li> Lasciare che il idrossiapatite di stabilirsi sotto la forza di gravità per 30 minuti. </li><li> Scolare buffer da colonna e rubinetto vicino. Combina acidi nucleici con tampone fosfato 0.12M in un volume finale di 500 microlitri e incubare a 60 ° C per 10 minuti in un blocco di calore o bagnomaria. </li><li> Applicare rapidamente gli acidi nucleici, preparato in tampone fosfato 0.12M alla idrossiapatite con una pipetta sierologica 2ml facendo attenzione a non disturbare la colonna. </li><li> Lasciare gli acidi nucleici di legarsi alla idrossiapatite per 30 minuti. </li><li> Posizionare un tubo 15ml sotto la colonna, aprire il rubinetto e raccogliere il campione iniziale, contenente ssDNA. Chiudere rubinetto. </li><li> Aggiungere 6 ml di tampone fosfato 0.12M alla idrossiapatite facendo attenzione a non disturbare la colonna, aprire il rubinetto e raccogliere DNA a singolo filamento nel tubo 15ml dal passaggio precedente. Chiudere rubinetto. </li><li> Aggiungere 1 volume di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:25:1 v / v / v) al tubo, mescolare vigorosamente e centrifugare a 3500 xg per 15 minuti. Trasferire il supernatante contenente ssDNA di un nuovo tubo 15ml. </li><li> Ripetere 3,76 e 3,87 con 6 ml di tampone fosfato 0.20m per postaliuto e RNA purificare dalla colonna facendo attenzione a utilizzare un nuovo tubo 15ml per la raccolta. </li><li> Ripetere 3,76 e 3,87 con 6 ml di tampone fosfato 0.40m per eluire e purificare dsDNA dalla colonna facendo attenzione a utilizzare un nuovo tubo 15ml per la raccolta. </li><li> Ripetere 3,76 e 3,87 con 6 ml di tampone fosfato 1,00 m di togliere la colonna di qualsiasi residuo dsDNA assicurandosi di utilizzare un nuovo tubo 15ml per la raccolta. </li></ol> 4. Dissalazione campioni acidi nucleici <ol><li> Trasferimento 4-5 ml di campione ad un Amicon Ultra-4 dispositivo centrifugo filtro dotato di un peso molecolare 30.000 tagliato membrana Ultracel. </li><li> Concentrato campione &lt;500μl di filatura a 6.000 xg, 30 ° C, 5 minuti (o fino a quando il volume concentrato si ottiene) in un rotore ad angolo fisso. Gettare flusso attraverso. </li><li> Aggiungere il resto del campione (s) per l'Ultra-4 Amicon dispositivo centrifugo filtro e portare il volume fino a 4 da 5 ml con tampone TE 1X RNase libero. </li><li> Concentrato campione &lt;500μl di filatura a 6.000 xg, 30 ° C, 5 minuti (o fino a quando il volume concentrato si ottiene) in un rotore ad angolo fisso. Gettare flusso attraverso. </li><li> Aggiungere 4-5 ml di tampone TE 1X RNase libera al sistema Ultra-4 Amicon dispositivo centrifugo filtro. Concentrato campione &lt;500μl per centrifugazione a 6.000 xg, 30 ° C, 5 minuti (o fino a quando il volume concentrato si ottiene) in un rotore ad angolo fisso. Gettare flusso attraverso. </li><li> Ripetere il passo 4,5 un ulteriore 5 volte per desalt completamente campione di acido nucleico (s). </li><li> Trasferimento del campione rimanente (s) ad un tubo sterile 1.7ml eppendorf. Aggiungi 1/10th volume di acetato di sodio 3M, pH 7,0, due volumi di etanolo 100%, e 1ml di Glycoblue. Mescolare bene nel vortex. </li><li> Centrifugare a 28000 xg, a 4 ° C, 60 minuti. Decantare facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 300μl di etanolo 70%. Spin a 28.000 xg, temperatura ambiente per 10 minuti. Decantare, asciutto e risospendere ogni frazione in un volume adeguato di RNasi-free tampone TE. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: La Figura 1 riassume i metodi presentati per l'utilizzo di cromatografia idrossiapatite di frazionare ssDNA, dsDNA e gli acidi nucleici RNA da un assemblaggio misto virale. Questo metodo sfrutta l'interazione di carica tra la dorsale fosfato con carica negativa degli acidi nucleici e la carica positiva di Ca 2 + ioni presenti nella idrossiapatite e consente il frazionamento efficiente dei sottotipi acido nucleico (ssDNA, dsDNA e RNA), con concentrazioni crescenti di buffer fosfato 12. Il frazionamento di un idrossiapatite in vitro "comunità" di noti ssDNA (M13mp18), dsDNA (lambda) e RNA (MS2 e phi6) genomi virali è illustrato in Figura 2. Gli acidi nucleici sono stati combinati in concentrazione pari, applicata alla colonna di idrossiapatite e sono stati eluiti con una crescente concentrazione del tampone fosfato. Ogni sottotipo acido nucleico eluisce indipendente dalle altre, con meno del 9% riporto da una frazione all'altra. L'applicazione di questa tecnica per gli acidi nucleici isolato da una comunità virale raccolti dalla Baia di Chesapeake è mostrata in Figura 3. La resa totale di acidi nucleici isolato dal virus purificato è stato applicato alla colonna di idrossiapatite. Materiale genomico composto da ssDNA, RNA e DNA a doppia elica era indipendentemente eluiti con 0.12M, 0.20m 0.40M/1.00M e le concentrazioni di tampone fosfato, rispettivamente. DNA a doppia elica viene eluita a concentrazioni di fosfato e di 1,00 m e 0,40 m in questo caso, domina questa comunità virale rispetto ai genotipi ssDNA e RNA. Questa osservazione è coerente con la composizione prevista comunità virale di ambienti marini e di estuario, dove la maggior parte degli acidi nucleici sono recuperabili dsDNA 13. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso del metodo di cromatografia idrossiapatite per il frazionamento degli acidi nucleici. Una miscela di ssDNA, dsDNA e RNA, preparato in tampone fosfato 0.12M viene riscaldato a 60 ° C e applicata a una colonna di idrossiapatite mantenuto alla temperatura costante di 60 ° C con un bagno di acqua circolante. Acidi nucleici (ssDNA, RNA e dsDNA) sono eluiti dalla idrossiapatite con concentrazioni crescenti di un fosfato, contenente tampone. Questo dato è stato riprodotto con il permesso di Società Americana di Microbiologia ed è stato originariamente nel Andrews-Pfannkoch et al. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Separazione delle note acidi nucleici virali mediante cromatografia idrossiapatite. Concentrazioni pari di M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA e lambda dsDNA (corsie 2-5, rispettivamente) sono stati combinati (corsia 6) e applicata a una colonna di idrossiapatite. Single-DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) e dsDNA (lambda) erano indipendentemente eluito idrossiapatite con 0.12M (corsia 8), 0.18M (corsia 9) e 0.40M/1.00M (corsia 10) . Una scala 1kb (corsie 1, 7) è stato usato per confermare le dimensioni del genoma. Questo dato è stato riprodotto con il permesso di Società Americana di Microbiologia ed è stato originariamente nel Andrews-Pfannkoch et al. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Separazione di acidi nucleici virale isolato da una comunità all'interno della Baia di Chesapeake. Gli acidi nucleici sono stati isolati e applicato a una colonna di idrossiapatite. ssDNA (corsia 0.12M), RNA (corsia 0.20m) e dsDNA (corsie 0.40M/1.0M) erano indipendentemente eluiti utilizzando le concentrazioni di tampone fosfato di 0.12M, 0.20m e 0.40M/1.00M, rispettivamente. Ladder Messa hi DNA (corsia L1) e Ladder 1kb (corsia L2) sono stati utilizzati per confermare visivamente approssimativo peso molecolare e la massa degli acidi nucleici. Questo dato è stato riprodotto con il permesso di Società Americana di Microbiologia ed è stato originariamente nel Andrews-Pfannkoch et al. 2010 12.

<ol><li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotes%3A+The+Unseen+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+evolution+of+the+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Popul+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li>
<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+Evolution+of+the+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li>
<li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay%3A+Implications+for+Prophage+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li>
<li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition%3A+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li>
<li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Viruses+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li>
<li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li>
<li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li>
<li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li>
<li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li>
<li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA%2C+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li>
<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La metodologia cromatografia idrossiapatite qui presentato è uno strumento altamente efficiente e robusto per il frazionamento degli acidi nucleici da assemblaggi misti virale, quando l&#39;obiettivo è quello di studiare la composizione totale di acidi nucleici della comunità. In generale, ssDNA, RNA e DNA a doppia elica si eluire dalla colonna pho concentrazioni di tampone fosfato maggiore di circa 0.40m 0e ~ rispettivamente. Tuttavia, ogni preparazione di idrossiapatite può avere una composizione leggermente ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del materiale </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Econo-Colonna </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0,7 centimetri pacchetto ID / 2 </td></tr><tr><td> Idrossiapatite </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> DNA Grado Bio-Gel Gel HTP, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Fosfato di sodio, monobasico </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monoidrato, Crystal 500g </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio, bibasico </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Anidro, Polvere 500g </td></tr><tr><td> DEPC trattati con acqua </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS Soluzione </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> Ultrapura, 1L </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8,0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml sierologici pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Polistirene, sterili </td></tr><tr><td> BD Falcon Centrifuga Tubi </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15 ml, sterili </td></tr><tr><td> Fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> Ultrapura, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 dispositivo centrifugo </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 membrana </td></tr><tr><td> TE buffer 20X, RNasi libero </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separazione di dna a singolo filamento, doppia elica del dna e rna da una comunità ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

I virus, in particolare batteriofagi (fagi), sono le entità più numerosi biologica sulla Terra 1,2. I virus modulare cellula ospite abbondanza e la diversità, contribuiscono alla cicli dei nutrienti, alterare ospitare fenotipo delle cellule, e influenza l&#39;evoluzione di entrambi cellula ospite e le comunità virale attraverso il trasferimento laterale dei geni 3. Numerosi studi hanno messo in evidenza la diversità sconcertante genetica dei virus e delle loro potenzialità funzionali in una varietà di ambienti naturali. Tecniche di metagenomica sono state utilizzate per studiare la diversità tassonomica e le potenzialità funzionali di complessi assemblaggi virale i cui componenti contengono DNA a singolo filamento (ssDNA), DNA a doppia elica (dsDNA) e RNA genotipi 4-9. Attuali protocolli di costruzione della libreria usata per studiare l&#39;ambiente del DNA-RNA contenenti o contenenti virus richiedono un trattamento iniziale nucleasi al fine di rimuovere i modelli nontargeted 10. Tuttavia, una comprensione globale del complemento gene collettiva della comunità virus e la diversità del virus richiede la conoscenza di tutti i membri indipendentemente dalla composizione del genoma. Frazionamento di acido nucleico purificato sottotipi fornisce un meccanismo efficace per lo studio assemblaggi virale senza sacrificare un sottoinsieme della firma genetica della comunità. Idrossiapatite, una forma cristallina di fosfato di calcio, è stato impiegato nella separazione degli acidi nucleici, così come le proteine ​​e microbi, dal 1960 11. Sfruttando l&#39;interazione tra la carica a carica positiva Ca 2 + ioni di idrossiapatite e la spina dorsale fosfato con carica negativa dei sottotipi acidi nucleici, è possibile eluire preferenzialmente ogni sottotipo di acido nucleico indipendente dagli altri. Recentemente abbiamo utilizzato questa strategia per frazionare in maniera indipendente i genomi di ssDNA, dsDNA e RNA contenenti virus, in preparazione di sequenziamento del DNA 12. Qui, vi presentiamo un metodo per il frazionamento ed il recupero di ssDNA, dsDNA e RNA virale acidi nucleici da assemblaggi misti virale mediante cromatografia in idrossiapatite.

Descriviamo un metodo efficace per separare singolo filamento di DNA a doppio filamento di DNA e le molecole di RNA virale ambientale comunità. Gli acidi nucleici sono frazionate mediante cromatografia di idrossiapatite con concentrazioni crescenti di fosfati contenenti buffer. Questo metodo consente l&#39;isolamento di tutti i tipi virali acidi nucleici da campioni ambientali.

Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

I virus, in particolare i batteriofagi (fagi), sono le entità biologiche più numerose sulla Terra1,2. I virus modulano l'abbondanza e la diversità delle cellule ospiti, ...

Questo video illustra una procedura per separare assemblaggi virali misti in base alla loro composizione di acidi nucleici. Questo consente lo studio della diversità tassonomica e del potenziale funzionale di assemblaggi virali complessi. In questo caso, l'idrossiapatite, una forma cristallina di fosfato di calcio, viene utilizzata per la separazione degli acidi nucleici.Prima di tutto, si impacchetta e si equilibra una colonna di idrossiapatite; successivamente, si applicano sulla colonna gli acidi nucleici virali purificati. L'interazione elettrostatica tra gli ioni calcio positivi dell'idrossiapatite e la struttura fosfato negativa degli acidi nucleici ne determina il legame alla colonna. Successivamente, il DNA-RNA a singolo filamento e il DNA a doppio filamento vengono eluiti in modo sequenziale utilizzando concentrazioni diverse di tampone fosfato. Gli acidi nucleici ottenuti vengono quindi desalati e concentrati, in previsione della loro visualizzazione, quantificazione e identificazione mediante sequenziamento del DNA. L'elettroforesi su gel di agarosio conferma che le diverse specie di acidi nucleici possono essere separate con un trasferimento incrociato inferiore al 9%.P

separation-single-stranded-dna-double-stranded-dna-rna-from-an

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Descriviamo un metodo per l'estrazione di alto peso molecolare del DNA genomico da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 micron Sterivex, seguita da centrifugazione in gradiente di cesio cloruro di densità per la purificazione.

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

Forniamo un protocollo migliore per l'estrazione del DNA alto peso molecolare da stuoie microbica hypersaline. Cellule microbiche sono separate dalla matrice tappetino prima dell'estrazione del DNA e la purificazione. Questo aumenta la concentrazione, la qualità e le dimensioni del DNA. Il protocollo può essere utilizzato per altri campioni refrattari.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica

Isotachophoresis (ITP) è una separazione solido elettrocinetico e tecnica preconcentrazione con applicazioni che vanno dal rilevamento della tossina alla preparazione del campione. Esaminiamo i principi fisici di ITP e la metodologia di applicazione di questa tecnica per due applicazioni specifiche esempio: separazione e la rilevazione di piccole molecole e di purificazione degli acidi nucleici da lisato di coltura cellulare.

On-Chip Isotachophoresis per separazione degli ioni e purificazione di acidi nucleici

Genomica singolo virus (SVG) è un metodo per isolare e amplificare il genoma di singoli virons. Sospensioni virali di un assemblaggio misto sono ordinati mediante citometria a flusso su un vetrino da microscopio con pozzi discrete contenenti agarosio, catturando così il virione e la riduzione del genoma taglio durante la lavorazione a valle. Intero genoma amplificazione viene ottenuta utilizzando multipla di amplificazione dello spostamento (MDA) risultante in materiale genomico che è adatto...

Isolamento e analisi del genoma di virioni singole utilizzando &quot;Genomica singolo virus &#39;

Fonte: Dembowski, J. A., et al. Purificazione del DNA virale per l'identificazione di proteine virali e cellulari associate. J. Vis. Exp. (2017).Questo video illustra l'isolamento di complessi proteina-DNA virale da nuclei cellulari mediante chimica click e purificazione con microsferette magnetiche. Il protocollo prevede l'etichettatura dei genomi virali con nucleotidi modificati con alchino, la biotinilazione tramite reazione click e il legame a microsferette magnetiche rivestite con...

Isolamento di proteine da complessi DNA virale-proteina

Utilizzando fibrosi cistica vie respiratorie come esempio, il manoscritto presenta un flusso di lavoro comprendente una combinazione di approcci metagenomiche e metatranscriptomic per caratterizzare la comunità microbiche e virali in campioni animali-associata.

Purificare l&#39;Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

Qui, presentiamo un protocollo completo per valutare la disponibilità di nutrienti organici e inorganici e l'abbondanza e la struttura delle comunità microbiche e virali in ambienti marini remoti.

Svelare i giocatori invisibili del Mare - Una guida del campo di Acqua Chimica e microbiologia marina

Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

L'obiettivo del presente protocollo è specificamente tag e isolare selettivamente il DNA virale da cellule infettate per la caratterizzazione delle proteine del genoma virale associato.

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la generazione e la purificazione di vettori virali adeno-associati utilizzando un metodo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina. Presenta un approccio semplice, scalabile ed economico, eliminando la necessità di ultracentrifugazione. I vettori risultanti mostrano un'elevata purezza e attività biologica, dimostrando il loro valore negli studi preclinici.

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Questo protocollo descrive un metodo conveniente per accelerare l'estrazione del DNA plasmidicale. Utilizzando rack personalizzati stampati in 3D compatibili con rotori standard a piastra a secchio oscillante, i ricercatori possono processare fino a 48 colonne di rotazione con tappi o fino a 116 colonne di rotazione senza condensatori simultaneamente, riducendo significativamente i tempi di manipolazione rispetto ai metodi manuali con microcentrifughe.

Estrazione del DNA a colonna a media velocità utilizzando rack a 24 pozzi

Scopri la separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica e RNA da comunità virali ambientali usando la cromatografia idrossiapatite. Questo metodo consente di studiare la diversità e il potenziale funzionale dei virus.

Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite (Video) | JoVE Journal

Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Esplora altri video