Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Questo video mostra una procedura per separare assemblaggi virali misti in base alla loro composizione di acidi nucleici. Ciò consente lo studio della diversità tassonomica e del potenziale funzionale di assemblaggi virali complessi. Qui l'idrossiapatite, una forma cristallina di fosfato di calcio, viene impiegata nella separazione degli acidi nucleici.

In primo luogo, una colonna di idrossiapatite viene impacchettata e gli acidi nucleici virali purificati equilibrati vengono quindi applicati alla colonna, l'interazione di carica tra gli ioni calcio caricati positivamente dell'idrossiapatite e la spina dorsale del fosfato caricata negativamente dei sottotipi di acido nucleico lega gli acidi nucleici alla colonna Nick. Successivamente, il DNA a singolo filamento, D-N-A-R-N-A e a doppio filamento sono allusi in sequenza con diverse concentrazioni di tampone fosfato. Gli acidi nucleici risultanti vengono quindi desalinizzati e concentrati in preparazione per la visualizzazione, la quantificazione e l'identificazione mediante sequenziamento del DNA L'elettroforesi su gel agros conferma che le specie di acidi nucleici possono essere separate con un carryover inferiore al 9%.

Pertanto, questo metodo consente di valutare la diversità e la capacità funzionale delle comunità virali. Ciao, mi chiamo Doug Fro e sono un ricercatore associato nel laboratorio del Dr.Shannon Williamson presso il J Craig Venture Institute. Oggi vi mostrerò una procedura per separare il DNA a singolo filamento, il DNA a doppio filamento e l'RNA da un assemblaggio virale ambientale.

Questo metodo presenta vantaggi rispetto ai metodi esistenti come il trattamento con il nucleo, che prende di mira sia il DNA che l'RNA. La cromatografia con idrossiapatite ha la capacità di catturare l'intera comunità virale. Questo metodo ci permette di rispondere a diverse domande nel campo dell'ecologia virale.

Ad esempio, qual è il complemento genico totale o la diversità della comunità virale? Abbiamo pensato per la prima volta a questo metodo quando volevamo studiare l'intero assemblaggio di plancton del Rio dalla baia di Chesapeake senza sacrificare un sottoinsieme della firma genetica. Le soluzioni necessarie per questo esperimento devono essere preparate in anticipo secondo le istruzioni contenute nel protocollo scritto allegato e includono 0,12 molari di tampone fosfato, 0,20 molare di tampone fosfato, 0,40 molare di tampone fosfato e una soluzione molare di fosfato.

Il tutto a pH 6,8 e idrossiapatite idrata il giorno dell'esperimento, equilibrare tutti i tamponi fosfato e l'idrossiapatite idrata mettendoli in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius. Iniziare questa procedura preparando la colonna econo che verrà utilizzata per la separazione degli acidi nucleici virali. Fissare un rubinetto all'estremità della colonna econo e assicurarsi che sia chiuso.

Usando un pipettatore aggiungere acqua deionizzata alla colonna, quindi posizionare il tappo sulla parte superiore della colonna e capovolgere ripetutamente la colonna per risciacquarla. Versare l'acqua e ripetere questo lavaggio più volte. Quindi, rimuovere il rubinetto di arresto dalla colonna dell'economia e sterilizzarlo in autoclave.

Il rubinetto di arresto non è in autoclave poiché si scioglie. Sciacquare il rubinetto di chiusura con acqua ionizzata, quindi di nuovo con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare all'aria dopo la sterilizzazione in autoclave. Riposizionare il rubinetto di chiusura e chiuderlo.

Successivamente, lavorando in una cappa aspirante, aggiungere un millilitro di sigma coat alla colonna e rivestire il vetro della colonna invertendo la colonna con un movimento rotatorio come mostrato qui. Il rivestimento con un rivestimento sigma ridurrà al minimo l'adesione degli acidi nucleici alla superficie del vetro. Durante la separazione, sono state rivestite le superfici di un vetro di sale.

Aprire il rubinetto di arresto e travasare in un tubo conico. Successivamente, per collegare la colonna a un bagno d'acqua circolante, utilizzare due morsetti per fissare la colonna a un supporto ad anello. Collegare il tubo in silicone dal bagnomaria circolante, in modo che il flusso dell'acqua dal bagnomaria sia dal basso verso l'alto.

Impostare la temperatura a 60 gradi Celsius e avviare la circolazione. Mentre in pratica, la colonna e il tubo sarebbero avvolti da un agente isolante, come un foglio di alluminio o un isolamento del tubo in schiuma. Per ridurre al minimo la perdita di calore, questo passaggio non viene mostrato qui.

Per visualizzare meglio la procedura, chiudere il rubinetto di arresto. Utilizzando un pipettatore, aggiungere 10 millilitri di acqua sterile priva di RNA. Aprire il rubinetto di chiusura e far defluire l'acqua.

Quindi lavare nuovamente dopo il secondo lavaggio. Risciacquare due volte con 10 millilitri di tampone fosfato molare 0,12 senza RNA sterili e decantare tra un lavaggio e l'altro. La colonna è ora pronta per la cromatografia con idrossiapatite.

Assicurarsi che il rubinetto di arresto della colonna dell'economia sia chiuso. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica sterile da due millilitri, aggiungere lentamente due millilitri di appetito idrossilato reidratato risospeso preparato sul fondo della colonna. Riposizionare il tappo della colonna.

Lascia che l'appetito idrossilato si depositi sotto la forza di gravità per 30 minuti. Questo metodo richiede attenzione ai dettagli. La colonna di appetito idrossilato viene elaborata a una velocità compresa tra 0,25 e 0,5 mil al minuto.

Quindi è molto importante tenere d'occhio la colonna in modo che non si secchi. Trascorsi 30 minuti, aprire il rubinetto di chiusura per scaricare il tampone in un contenitore per rifiuti. Chiudere il rubinetto di chiusura e scartare il flusso attraverso.

Combinare gli acidi nucleici con un tampone fosfato molare 0,12 in un volume finale di 500 microlitri e incubarlo a 60 gradi Celsius per 10 minuti. Questo equilibrerà gli acidi nucleici alla temperatura della colonna e migliorerà la separazione delle diverse specie di acidi nucleici rimuovendo eventuali strutture secondarie che potrebbero essere presenti. Utilizzando una pipetta sierologica da due millilitri, applicare rapidamente la soluzione di acido nucleico sull'appetito idrossilato, facendo attenzione a non disturbare la colonna.

Una volta che tutti i 500 microlitri fluiscono sulla colonna, è possibile aggiungere una piccola quantità di tampone fosfato molare da 0,12 molari alla parte superiore della colonna per evitare che si secchi. Lasciare che gli acidi nucleici si leghino all'appetito idrossilato per 30 minuti. Dopo l'incubazione del legame, posizionare una provetta conica da 15 millilitri sotto la colonna.

Quindi aprire il rubinetto di arresto e raccogliere il campione iniziale di 500 microlitri, che contiene DNA a singolo filamento. Una volta raccolti 500 microlitri, chiudere il rubinetto di arresto. Quindi, aggiungi sei millilitri di tampone fosfato molare 0,12 all'appetito idrossilato, assicurandoti di non disturbare la colonna.

Quindi aprire il rubinetto di arresto e continuare a raccogliere il flusso contenente DNA a filamento singoletto nello stesso tubo da 15 millilitri del passaggio precedente. Dopo aver raccolto circa sei millilitri, chiudere il rubinetto. Aggiungere un volume di una soluzione di alcol isoamilico fenolo cloroformio alla provetta miscelata energicamente mediante vorticizzazione, quindi centrifugare a 3, 500 volte G per 15 minuti.

Dopo la centrifugazione, la provetta conterrà due strati. Trasferire lo strato superiore di acquiescenza, che contiene il singolo filamento di DNA in una nuova provetta da 15 millilitri, e conservare il campione a temperatura ambiente per eluire e purificare l'RNA Dalla colonna, aggiungere sei millilitri di tampone fosfato molare da 0,20 molari e raccogliere il flusso prima di utilizzare una nuova provetta da 15 millilitri. Quindi eseguire un'estrazione con cloroformio fenolo.

Per quanto riguarda il campione di DNA a singolo filamento, ripetere questo processo utilizzando sei millilitri di tampone fosfato molare 0,40 per eluire e purificare il DNA a doppio filamento dalla colonna. Infine, spogliare la colonna di qualsiasi residuo di DNA a filamento doppietto. Ripeti questo processo ancora una volta.

Questa volta utilizzando sei millilitri di tampone fosfato molare da 1,00 per desalinizzare i campioni di acido nucleico. Trasferire da quattro a cinque millilitri di ciascun campione in un dispositivo di filtro centrifugo ultra quattro dotato di un campione concentrato di membrana ultracellulare con cutoff di 30.000 pesi molecolari a meno di 500 microlitri ruotando a 6.000 GS a 30 gradi Celsius per circa cinque minuti in un rotore ad angolo fisso. Dopo aver scartato il flusso, aggiungere il resto dei campioni al filtro.

Porta il volume fino a quattro o cinque millilitri con RNA libero un tampone XTE. Quindi centrifugare di nuovo fino a raggiungere un volume concentrato. Circa cinque minuti dopo la centrifuga, aggiungere da quattro a cinque millilitri di RNA liberando un tampone XTE al filtro e concentrare.

Anche in questo caso, ripetere questo lavaggio e altre cinque volte per dissalare completamente i campioni di acido nucleico. Una volta che i campioni sono stati completamente concentrati e dissalati, trasferire i campioni di acido nucleico rimanenti in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Precipitare gli acidi nucleici aggiungendo un decimo del volume di acetato di sodio, due volumi di etanolo al 100% e un microlitro di glico blu miscelato bene mediante centrifuga a vortice.

A 28.000 GS quattro gradi Celsius. 60 minuti per il Kent. Facendo attenzione a non disturbare il pellet.

Aggiungere 300 microlitri di spin di etanolo al 70% a 28.000 GS di temperatura ambiente per 10 minuti per non asciugare e risospendere ogni frazione in un volume appropriato di RNA. Sono state combinate concentrazioni uguali di tampone TE libero degli acidi nucleici virali M 13 MP 18, DNA a singolo filamento MS a due filamenti, RNA FI a sei filamenti, RNA e DNA lambda a doppio filamento, quindi separati utilizzando la cromatografia a idrossiapatite come mostrato in questo video. Concentrazioni uguali di M 13 MP 18, DNA a singolo filamento MS due, singolo filamento, RNA cinque sei a doppio filamento, RNA e Lambda a doppio filamento sono state combinate come mostrato nella corsia sei e applicate a una colonna di idrossiapatite come si può vedere qui.

Il DNA a singolo filamento D-N-A-R-N-A e il DNA a doppio filamento sono stati allusi in modo indipendente dalla colonna di idrossiapatite utilizzando tampone fosfato 0,12 molare, 0,18 molare, 0,40 molare e 1,00 molare. Una scala da un KB è stata utilizzata per confermare le dimensioni del genoma. Questi risultati indicano che questo metodo può essere utilizzato per separare con successo il DNA a filamento singolo, il DNA a doppio filamento e l'RNA con meno del 9% di carryover da una frazione all'altra.

Questo metodo è stato utilizzato anche per separare gli acidi nucleici isolati da una comunità virale all'interno della baia di Chesapeake, come mostrato qui. Il DNA a singolo filamento D-N-A-R-N-A e il DNA a doppio filamento sono stati allusi in modo indipendente utilizzando concentrazioni di tampone fosfato di 0,12 molari, 0,20 molari e 0,40 molari o 1,00 molari rispettivamente La scala del DNA ad alta massa nella corsia uno e una scala KB nella corsia due sono state utilizzate per confermare visivamente il peso molecolare approssimativo e la massa degli acidi nucleici, come si può vedere qui, il DNA a doppio filamento era il tipo di acido nucleico dominante estratto dal plancton Verio della baia di Chesapeake. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come separare gli acidi nucleici da un assemblaggio virale misto utilizzando la cromatografia con idrossiapatite.

Ciò include la preparazione della colonna di idrossiapatite e degli acidi nucleici, la separazione e l'illusione degli acidi nucleici utilizzando varie concentrazioni di tampone fosfato e desalinizzazione e la concentrazione degli acidi nucleici dopo la separazione.