JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:28 min. • April 28th, 2025
Prendi una piastra multipozzetto contenente cellule simili a microglia che mostrano attività fagocitaria.
Incuba con una colorazione nucleare per etichettare i nuclei.
Aggiungi un inibitore della polimerizzazione dell'actina al pozzetto di controllo negativo.
Durante l'incubazione, l'inibitore si lega ai filamenti di actina, inibendo la polimerizzazione dell'actina e la fagocitosi.
Mantieni la piastra a basse temperature e aggiungi sinaptosomi umani marcati con colorante sensibile al pH--frammenti isolati di terminali sinaptici neurali.
Centrifuga la piastra a basse temperature per favorire le interazioni cellula-sinaptosoma ma prevenire l'assorbimento prematuro.
Trasferisci la lastra a un sistema di imaging di cellule vive.
Nel pozzetto del test, i sinaptosomi vengono fagocitati e si fondono con i lisosomi formando fagolisosomi. L'ambiente acido lisosomiale attiva il colorante, determinandone la fluorescenza.
Nel corso del tempo, nel pozzetto del test, vengono inghiottiti più sinaptosomi causando un ulteriore aumento della fluorescenza.
Tuttavia, nel pozzo di controllo negativo, la polimerizzazione dell'actina è inibita, impedendo l'assorbimento del sinaptosoma. La fluorescenza minima risultante conferma la dipendenza della fluorescenza dalla fagocitosi mediata dall'actina.
Il giorno del test, rimuovi 40 microlitri di terreno per pozzetto e aggiungi 10 microlitri della soluzione di colorazione nucleare. Incubare la piastra per due ore. Scongelare i sinaptosomi marcati sul ghiaccio e sonicare delicatamente utilizzando un sonicatore ad acqua per un minuto. Ancora una volta, posiziona immediatamente i sinaptosomi sul ghiaccio. Diluire i sinaptosomi marcati e il terreno completo IMG a 1 microlitro di sinaptosomi per 50 microlitri di terreno.
Per un controllo negativo, prepara 60 micromolari di citocalasina D in terreno completo IMG per inibire la polimerizzazione dell'actina e quindi la fagocitosi. Quindi, aggiungere 10 microlitri di questa soluzione a ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 10 micromolari e incubare per 30 minuti. Togliete la piastra dall'incubatrice e incubatela a 10 gradi Celsius per 10 minuti. Mantenere la piastra sul ghiaccio e aggiungere 50 microlitri di terreno contenente sinaptosomi.
Centrifuga la lastra a 270 volte g per tre minuti a 10 gradi Celsius e mantieni la piastra sul ghiaccio fino all'acquisizione dell'imaging. Inserire la piastra in un lettore di imaging di cellule vive e selezionare i pozzetti da analizzare. Quindi, seleziona un obiettivo 20x. Quindi, regolare la messa a fuoco, il diodo a emissione di luce o il tempo di integrazione dell'intensità del LED e il guadagno del campo luminoso e dei canali blu. La fluorescenza dei sinaptosomi dovrebbe essere trascurabile al momento iniziale.
Seleziona il numero di singole tessere da acquisire in un montaggio per pozzo. Acquisisci 16 tessere al centro del pozzo, riproducendo circa il 5% dell'area totale del pozzo. Impostare la temperatura su 37 gradi Celsius e l'intervallo di tempo desiderato per l'imaging.