Immunomarcatura delle proteine della membrana neuronale in un campione di tessuto cerebrale di topo con frattura da congelamento

Prendi un campione di tessuto cerebrale di topo congelato in un tampone.

Il campione è rivestito di platino per migliorare i dettagli della superficie e di carbonio per la stabilità strutturale.

Trasferisci il campione in una fiala con un tampone per la digestione contenente detersivo.

Incubare per facilitare la rottura dei tessuti, lasciando intatta la membrana e le proteine incorporate nel rivestimento.

Lavare con tampone per rimuovere i detriti.

Aggiungi una soluzione bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Introduci anticorpi primari specifici per la proteina della membrana neuronale bersaglio.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.

Incuba con anticorpi secondari coniugati con oro che si legano agli anticorpi primari.

Lava con tampone per rimuovere gli anticorpi in eccesso.

Risciacqua con acqua per evitare artefatti da residui di sale durante la microscopia.

Monta il campione su un microscopio elettronico a trasmissione o su una griglia TEM.

Sotto il TEM, visualizza la proteina bersaglio della membrana neuronale identificata dalle particelle d'oro, che appaiono come punti neri.

Per la digestione SDS, trasferire una replica in una fiala di vetro da 4 millilitri riempita con 1 millilitro di tampone per la digestione SDS. Lasciarlo digerire per 18 ore a 80 gradi Celsius agitandolo. Per l'immunomarcatura, lavare la replica per 10 minuti in un tampone di digestione SDS fresco. Quindi, incubarlo con anticorpi primari e secondari diluiti in BSA TBS al 2% in una camera umida a 15 gradi Celsius per 24-72 ore.

Successivamente, montare la replica su una griglia a barre parallele a 100 linee rivestita in formvar. Immagina la replica con un microscopio elettronico a trasmissione a 80 o 100 kilovolt. Acquisire quindi le immagini digitali attraverso una telecamera CCD.