Immunoprecipitazione nativa della cromatina delle cellule della neurosfera

Prendi le cellule della neurosfera in un tampone contenente detergenti, calcio e inibitori della proteasi.

Il detergente permeabilizza le cellule, mentre l'inibitore inattiva le proteasi per preservare la proteina bersaglio legata alla cromatina.

Aggiungere la nucleasi e incubare. La nucleasi utilizza il calcio per digerire la cromatina.

Aggiungere un tampone contenente EDTA che chela il calcio, inattivando la nucleasi.

Aggiungere il tampone di lisi per lisare le cellule, rilasciando la cromatina.

Centrifugare e raccogliere il surnatante.

Aggiungere anticorpi specifici per la proteina bersaglio e incubare con rotazione. Centrifugare e rimuovere il surnatante.

Introdurre microsfere magnetiche mirate all'anticorpo e incubare con la rotazione.

Aggiungere il tampone di lisi per separare il DNA non specificamente legato.

Cattura magneticamente le perle e rimuovi il surnatante.

Aggiungere un tampone ad alto contenuto di sale per separare le proteine non specificamente legate.

Cattura magneticamente le perle e rimuovi il surnatante.

Aggiungere un tampone di stabilizzazione, catturare magneticamente le perle e rimuovere i contaminanti.

Risospendere in un tampone proteinasi-K per digerire le proteine, rilasciando il DNA.

Una volta raccolte le neurosfere, centrifugare 1 volte 10 alle 6 cellule della neurosfera per immunoprecipitazione a 300 volte g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, decantare il surnatante e risospendere il pellet di neurosfera in un millilitro di soluzione salina bilanciata. Trasferire la sospensione in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri a basso legame proteico, quindi centrifugare come prima.

Successivamente, decantare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 95 microlitri di tampone di digestione integrato da 1 a 100 con un cocktail di inibitori della proteasi per 1 volte 10 per le 6 cellule. Pipettare immediatamente le cellule su e giù per evitare la formazione di grumi ed evitare la formazione di bolle. Quindi mescolare 5 microlitri di nucleasi micrococcica 0,1x e 145 microlitri di tampone per la digestione e aggiungere 5 microlitri di nucleasi micrococcica diluita per 1 volte 10 alle 6 cellule. Muovi il tubo per mescolare e posiziona il tubo in un blocco di calore a 37 gradi Celsius per esattamente 12 minuti.

La digestione della nucleasi micrococcica per frammentare la cromatina è il passaggio più critico. Una corretta frammentazione della cromatina è importante per ottenere un'alta risoluzione per ChIP. Per garantire il successo di questa fase, incubare più campioni uno alla volta per garantire che non si verifichi una digestione eccessiva.

Dopo 12 minuti, aggiungi 10 microlitri di 10x tampone di arresto della nucleasi micrococcica per 1 volte 10 alle 6 cellule. I campioni devono essere conservati in ghiaccio da questo punto in poi. L'analisi del bioanalizzatore del campione digerito di nucleasi micrococcica dimostra che la maggior parte del DNA è stata frammentata in mono, di e trinucleosomi. Successivamente, aggiungere 110 microlitri di tampone RIPA 2x integrato da 1 a 100 con cocktail di inibitori della proteasi per 1 volte 10 alle 6 cellule.

Muovi la provetta per mescolare, quindi centrifuga per 15 minuti a 4 gradi Celsius e 1.700 volte g. Trasferisci il surnatante che contiene la cromatina in una normale provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e mettila sul ghiaccio. Utilizzare il tampone RIPA integrato con inibitori della proteasi da 1 a 1.000 per diluire la cromatina in modo che ogni IP abbia un volume da 100 a 200 microlitri. Quindi rimuovere un'aliquota equivalente al 10% del volume ChIP come campione di input.

Prepara l'input aggiungendo 100 microlitri di tampone TE integrato con proteinasi-K e incuba a 55 gradi Celsius per un'ora. Dopo aver purificato l'input con un kit di purificazione PCR, misurare la concentrazione dell'input utilizzando uno spettrofotometro a micro volume. Registra i risultati in un taccuino. Aggiungere 10 microlitri di microsfere magnetiche di proteina A e G lavate per IP che verranno eseguite su ciascun campione e incubare per un'ora a 4 gradi Celsius con rotazione a 20 RPM.

Posiziona il campione su un supporto magnetico e lascia che le perline si separino. Quindi trasferire il volume richiesto in nuove provette da 1,5 millilitri. Aggiungere l'anticorpo desiderato a ciascuna provetta e quindi avvolgere i tappi con un film di paraffina di plastica per evitare l'evaporazione. Incubare i campioni per una notte a 4 gradi Celsius con rotazione come prima. Il giorno successivo, centrifugare i tubi a 2000 volte g per 10 secondi. Quindi aggiungere 10 microlitri di perle a ciascun IP e incubare per tre ore a 4 gradi Celsius con rotazione a 20 giri/min.

Quindi posiziona i campioni su un supporto magnetico e lascia che le perle magnetiche si separino. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere 150 microlitri di tampone RIPA con inibitori della proteasi a ciascun IP e incubare a 4 gradi Celsius a 20 RPM per 5 minuti. Trascorso il periodo di incubazione, posizionare i campioni su un supporto magnetico e lasciare che le perle magnetiche si separino. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere 150 microlitri di tampone di cloruro di litio integrato con inibitori della proteasi a bassa concentrazione a ciascun IP e incubare a 4 gradi Celsius con rotazione a 20 RPM per 5 minuti.

Dopo il periodo di incubazione, posiziona i campioni su un supporto magnetico e lascia che le perle magnetiche si separino. Quindi utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere 150 microlitri di TE freddo senza inibitori della proteasi alle perle e incubare a 4 gradi Celsius con rotazione a 20 RPM per 5 minuti. Dopo l'ultima fase di lavaggio, risospendere il campione in 100 microlitri di tampone TE integrato con la concentrazione finale di 0,5 milligrammi per millilitro di proteinasi-K e incubare a 55 gradi Celsius per un'ora.