JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:01 min. • April 28th, 2025
Prendi un ratto di controllo anestetizzato e un modello di ratto con lesione cerebrale indotta dal laser.
L'applicazione laser sull'emisfero destro ha danneggiato le cellule e la barriera emato-encefalica, o BBB, che separa il sangue dal tessuto cerebrale.
Inietta un colorante tracciante nella vena caudale cannulata che viaggia attraverso la circolazione sistemica per raggiungere il cervello.
Il colorante si lega alle proteine plasmatiche e fuoriesce nel tessuto cerebrale attraverso la BBB danneggiata.
Eutanasia i topi.
Perfondi i ratti attraverso il cuore per eliminare il colorante dalla circolazione.
Estrai e affetta il cervello, isola le fette dall'emisfero ferito e omogeneizzale.
Tratta con una soluzione acida per denaturare le proteine, rilasciando il colorante legato alle proteine.
Centrifuga e isola il surnatante contenente colorante. Aggiungere alcol per migliorare la fluorescenza del colorante.
Trasferisci la soluzione in una micropiastra. Dopo l'eccitazione, una maggiore intensità di fluorescenza nel cervello danneggiato indica un danno alla BBB indotto dal laser.
Per valutare l'incidenza della rottura della barriera emato-encefalica, 24 ore dopo la lesione indotta dal laser, caricare una siringa con colorante blu Evans al 2%, diluito in 4 millilitri per chilogrammo di soluzione salina, e somministrare la soluzione per via endovenosa ai ratti feriti e di controllo attraverso la vena caudale cannulata.
Lasciare circolare la soluzione per un'ora, prima di utilizzare set di perni chirurgici e forbici per aprire il torace del primo animale. Perfondere il cuore esposto, con soluzione fisiologica raffreddata allo 0,9% attraverso il ventricolo sinistro a 110 millimetri di mercurio di pressione, fino a quando non si osserva un liquido di perfusione incolore dall'atrio destro.
Quindi, raccogli il cervello e ottieni fette rostrocaudali di 2 millimetri. Separare le fette del cervello sinistro da quelle del cervello destro per consentire la valutazione separata degli emisferi danneggiati e non danneggiati e pesare i campioni. Omogeneizzare i campioni, utilizzando un mortaio e un pestello, e incubare i campioni di tessuto in acido tricloroacetico al 50% per 24 ore.
Il giorno successivo, centrifugato i campioni di tessuto cerebrale omogeneizzato, per 20 minuti a 10.000 volte g e temperatura ambiente. Mescolare 1 millilitro di surnatante con 1,5 millilitri di etanolo al 96% in rapporto 1 a 3. Quindi, utilizzare un rivelatore a fluorescenza a un'eccitazione di 620 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 680 nanometri per valutare la rottura della barriera emato-encefalica.