Imaging della dinamica intracellulare dell'ATP utilizzando sensori basati su FRET in una fetta di ippocampo di topo organotipico
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:40 min. • April 28th, 2025
Proteggi una fetta di ippocampo di topo organotipico in una camera sperimentale.
La fetta contiene neuroni e astrociti trasdotti che esprimono un sensore ATP con proteine fluorescenti donatrici e accettori.
Posiziona la camera su un tavolino per microscopio a fluorescenza e perfondila con ACSF ossigenato.
Consenti alla sezione di adattarsi alle condizioni memorizzate nel buffer.
Utilizzando la luce di trasmissione, focalizza la fetta e identifica l'area di interesse.
Passa alla modalità di fluorescenza ed eccita la proteina fluorescente del donatore per avviare l'emissione di fluorescenza.
Dopo il legame con l'ATP, il sensore subisce cambiamenti conformazionali, consentendo il trasferimento di energia basato sulla fluorescenza dal donatore all'accettore, che emette fluorescenza a una lunghezza d'onda maggiore.
Usa uno specchio dicroico e filtri passa-banda per isolare e separare le emissioni del donatore e dell'accettore.
Seleziona una regione senza fluorescenza per la sottrazione dello sfondo. Quindi, identifica le cellule bersaglio e registra la loro fluorescenza nel tempo.
Calcola il rapporto FRET per monitorare i livelli di ATP intracellulare in tempo reale.
Preparare l'ACSF sperimental
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