Utilizzo della riflettometria spettrale per determinare i diametri degli assoni mielinizzati in una fetta fissa di cervello di topo

Prendi un microscopio confocale iperspettrale con una sorgente laser stabilizzata configurata per un'ampia gamma spettrale per decodificare la nanostruttura della guaina mielinica del tessuto cerebrale.

Utilizzare uno specchio di riferimento per acquisire lo spettro di riflettanza della linea di base. Rimuovere lo specchio e acquisire uno spettro di offset scuro per la correzione del rumore del rivelatore.

Trasferire una camera con una sezione fissa di tessuto cerebrale al tavolino del microscopio.

Allineare il piano focale alla regione del tessuto di interesse, garantendo una profondità sufficiente per ridurre al minimo l'interferenza dall'interfaccia vetro-tessuto.

La luce laser è diretta sulla guaina mielinica multistrato degli assoni.

Quando la luce interagisce con la mielina, si verificano riflessioni parziali alle interfacce degli strati, producendo modelli di interferenza dovuti al variare degli spessori degli strati e degli indici di rifrazione.

Acquisire immagini spettrali di questi modelli di interferenza.

Dopo la correzione della linea di base e l'analisi del segnale, lo spettro di riflettanza rivela la periodicità del numero d'onda, consentendo la determinazione dei diametri degli assoni mielinizzati.

Montare uno specchio di riferimento sul tavolino del microscopio, con la superficie rivolta verso la lente dell'obiettivo. Se non è facile posizionare lo specchio sul tavolino del microscopio, far aderire uno specchio sulla piastra piana. Regolare il tavolino del microscopio per allineare il piano focale alla superficie dello specchio. Quindi, regolare il guadagno PMT e la potenza del laser, considerando la gamma dinamica del rivelatore.

Sotto uno pseudocolore, controlla che non ci sia saturazione in tutta la gamma di lunghezze d'onda. Se si osserva una saturazione, ridurre la potenza del laser. Quindi, eseguire l'acquisizione della scansione lambda. Rimuovere lo specchio dal tavolino e ripetere la stessa acquisizione senza un campione per ottenere il riferimento scuro. Quindi, salva i dati in un formato TIFF multi-stack.

Per eseguire l'acquisizione dell'immagine SpeRe, posizionare il tessuto montato sul tavolino del microscopio. Per allineare approssimativamente il tessuto al piano focale della lente dell'obiettivo, attraverso un oculare, utilizzare la modalità di fluorescenza ad ampio campo. Con la scansione in tempo reale attivata, controllare il tavolino del microscopio per allineare il piano focale alla regione di interesse nel tessuto. Per evitare il rumore di fondo del vetrino coprioggetti, selezionare una regione target di almeno 15 micrometri di profondità dall'interfaccia del tessuto di vetro.

Acquisire lo stack di immagini spettrali per la regione di destinazione utilizzando la stessa procedura illustrata in precedenza in questo video. Quindi, salva i dati per il tessuto e l'offset scuro in formato TIFF multi-stack. Per elaborare le immagini in ImageJ, aprire i dati spettrali per lo specchio di riferimento e il tessuto cerebrale.

Selezionare le ROI per le pile di immagini aperte, l'area centrale per lo specchio di riferimento e il segmento di una fibra assonale per il tessuto cerebrale. Quindi, esegui l'immagine, impila, traccia il profilo dell'asse z per acquisire gli spettri grezzi per le ROI selezionate.

Le fibre degli assoni possono essere strutturalmente eterogenee lungo le loro lunghezze, quindi si consiglia di selezionare il ROI su un piccolo segmento di assone, tipicamente inferiore a 5 micrometri, per ridurre al minimo gli artefatti di volume parziale.

Apri i dati di offset scuro, uno preso per lo specchio di riferimento e l'altro preso per il tessuto cerebrale, e traccia il profilo dell'asse z come appena dimostrato. Quindi, utilizza le opzioni di copia e incolla per salvare tutte le opzioni acquisite.