Microscopia a due fotoni per il monitoraggio della dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni retinici di topo

Posizionare un vetrino coprioggetti contenente tessuto retinico di topo montato su membrana sotto un microscopio a due fotoni.

Il tessuto esprime un biosensore di calcio basato su FRET nei fotorecettori dei coni.

Utilizzando un obiettivo a immersione in acqua, concentrarsi sul tessuto.

In condizioni di retroilluminazione, i terminali degli assoni dei coni rimangono depolarizzati, consentendo l'afflusso di calcio.

Il legame intracellulare del calcio altera la conformazione del biosensore, avvicinando i fluorofori donatore e accettore.

Inizia l'imaging a due fotoni.

Il laser del microscopio focalizza la luce a bassa energia nel vicino infrarosso nel tessuto.

Nel punto focale del laser, due fotoni eccitano simultaneamente il biosensore, innescando il trasferimento di energia dal donatore all'accettore.

Ciò aumenta la fluorescenza dell'accettore diminuendo la fluorescenza del donatore.

Calcola il rapporto di fluorescenza.

Successivamente, fornire una stimolazione luminosa per iperpolarizzare i coni, riducendo i livelli di calcio intracellulare.

Questo inverte la conformazione del biosensore, inibendo il trasferimento di energia dal donatore all'accettore e abbassando il rapporto di fluorescenza.

Registrare le risposte per analizzare la dinamica del calcio evocata dalla luce nei terminali degli assoni del cono.

Trasferire una fetta dalla camera di mantenimento alla camera di registrazione e iniziare immediatamente a perfonderla con una soluzione extracellulare carbossigenata. Mantenere una portata di perfusione di 2 millilitri al minuto e una temperatura di 37 gradi Celsius nella camera di registrazione. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua 20x, 0,95 NA e una telecamera CCD in combinazione con un LED a infrarossi sotto la camera di registrazione per localizzare la fetta di retina.

Avviare il sistema di imaging a due fotoni, come indicato dal produttore. Quindi, accendi il laser e impostalo a 860 nanometri. Attivare i due canali di rilevamento per l'imaging a fluorescenza di ECFP e citrino. Successivamente, utilizzando il software di acquisizione delle immagini, controllare il microscopio a due fotoni per la scansione e selezionare una fila di terminali a cono per la registrazione. Impostare l'acquisizione delle immagini su immagini da 128 x 16 pixel o una configurazione simile.

Limitare l'area scansionata ai terminali del cono per evitare lo sbiancamento dei fotopigmenti nei segmenti esterni. Accendi il laser. Lasciare che i coni si adattino al laser a scansione e alla luce di fondo dello stimolo per 20-30 secondi prima di presentare stimoli luminosi o applicare agenti farmacologici. Ora, inizia la presentazione degli stimoli arbitrari. Gli stimoli vengono generati modulando l'intensità dei due LED nel tempo, tramite una scheda a microprocessore controllata da un software personalizzato. Quindi, avviare la registrazione simultanea dei due canali di fluorescenza utilizzando il rispettivo software di acquisizione delle immagini.