Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart
September 13th, 2011
Questo articolo descrive le procedure di base per lo svolgimento di esperimenti di mappatura ottica nella Langendorff-perfuso cuore di coniglio con il sistema di imaging panoramico, e il doppio (tensione e calcio) modalità di imaging.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare le proprietà elettrofisiologiche cardiache come la conduzione, la ripolarizzazione, l'aritmogenesi e la manipolazione del calcio utilizzando tecniche di mappatura ottica nel cuore di coniglio perfuso di langor. Ciò si ottiene isolando e perfondendo retrogradamente un cuore di coniglio intatto attraverso l'aorta. Il passo successivo della procedura consiste nell'esporre la superficie del cuore, abolire le contrazioni del cuore, utilizzare la contrazione di eccitazione sulla statina Coler BLE e colorare correttamente il miocardio utilizzando indicatori sensibili alla tensione e fluorescenti di calcio.
Quindi le registrazioni dei potenziali d'azione ottici da gran parte dell'epicardio ventricolare vengono effettuate utilizzando il sistema di mappatura ottica panoramica. I segnali ottici vengono quindi mappati su una geometria 3D ricostruita della superficie epicardica del cuore. Durante questa fase, il potenziale d'azione ottico e il transitorio del calcio possono essere registrati contemporaneamente utilizzando il sistema di imaging doppio non panoramico.
Questa procedura fornisce dati quantitativi del miocardio spaziale e temporale, dell'eccitazione e della ripolarizzazione, nonché le caratteristiche congruenti della manipolazione del calcio, che possono essere analizzate sia durante il ritmo regolare che durante l'aritmia atriale e ventricolare. Ciao, mi chiamo Dr.Iger Eov. Sono professore di ingegneria biomedica presso la Washington University di St.Louis.
La tecnica ottica che presentiamo oggi è una tecnologia unica che presenta una serie di vantaggi rispetto ai tradizionali micro e micro elettrogrammi perché è in grado di registrare simultaneamente decine, decine di migliaia di potenziali d'azione e transitori di calcio. Inoltre, questa tecnologia è immune agli artefatti presentati dalla stimolazione elettrica e dalla defibrillazione, che distorcono fortemente i potenziali d'azione registrati da qualsiasi elettrogramma. Inoltre, i transitori di calcio potrebbero essere registrati solo con questa tecnica.
Non c'è alternativa. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dell'elettrofisiologia cardiaca, come i meccanismi di induzione, mantenimento e cessazione delle aritmie atriali e ventricolari potenzialmente letali, nonché la modellazione della funzione nella conduzione e nell'eccitazione e nell'accoppiamento di costruzione in malattie come la cardiopatia congenita, la malattia metabolica e l'insufficienza cardiaca. Una volta preparato per l'intervento chirurgico, sopprimere un coniglio con un cocktail di pentobarbital di sodio ed eparina.
Non appena il coniglio non risponde a un riflesso del dolore, apri il torace e asporta il cuore e i polmoni. Praticare un taglio all'estremità superiore dell'aorta ascendente prima che tutti i rami dell'arco aortico accendano la pompa per avviare il flusso della soluzione di Tyro nel sistema di perfusione LRF non ricircolante. Montare rapidamente il cuore sulla cannula aortica calibro 16 collegata al sistema di perfusione LOR.
Sciacquare l'aria dall'aorta e legare la cannula dell'aorta una volta completamente perfusa. Non perdere tempo a tagliare il pericardio. Quindi rimuovere il grasso polmonare, trachea, che circonda il cuore e i tessuti connettivi.
È molto importante prevenire l'accumulo di liquidi nel ventricolo sinistro, che produrrebbe ischemia. Quindi inserire un tubo di drenaggio in silicone attraverso una vena polmonare e una valvola mitrale e nel ventricolo sinistro. Ora sposta il cuore con la cannula sul sistema di perfusione di Andorf a ricircolo di lang dotato di sistema di mappatura ottica.
Posizionare il cuore in una camera esagonale su misura e collegare la cannula al sistema di perfusione. Monitorare la pressione aortica utilizzando un trasduttore di pressione e mantenerla a circa 60 più o meno cinque millimetri di mercurio regolando la portata della pompa di perfusione. Mantenere il pH intorno a 7,35 più o meno 0,05.
Spegnere la luce della stanza e iniettare lentamente la soluzione madre di statine BLEs sensibile alla luce attraverso la porta di iniezione nel trapper di bolle d'aria situato sopra la cannula. Per raggiungere una concentrazione di 10 BLEs micromolari, la statina inietta lentamente 0,1 millilitri di BLEs di statina. Per ogni iniezione in bolo, attendere che la pressione si stabilizzi prima dell'iniezione successiva.
Posizionare gli array di fotodiodi o PDA a tre angoli equidistanti attorno al cuore. Quindi, su ciascun palmare, focalizzare l'immagine del cuore sul vetro smerigliato del piano dell'immagine. Regolare la posizione della cannula nella camera esagonale e in ciascun PDA fino a quando il cuore non si inserisce nel campo visivo di tutti e tre i PDA.
Quindi scatta una foto di ogni immagine messa a fuoco sul vetro smerigliato. Iniettare lentamente da 10 a 20 microlitri di soluzione madre di D 4 Anep nella soluzione di perfusione attraverso la porta di iniezione nella trappola per bolle d'aria. E attendi tre minuti.
Quindi, posizionare delicatamente l'elettrodo di stimolazione nella posizione desiderata. Qui è posto al centro della vista anteriore del cuore. Iniziare a effettuare la registrazione ottica simultanea dai PDA.
Assicurarsi che non vi siano artefatti di movimento nel segnale ottico e che il rapporto segnale/rumore sia sufficiente per la successiva analisi dei dati. Al termine, accendi le luci della stanza e fai una registrazione fotografica del cuore scattando una fotografia ogni 10 gradi di rotazione da una fotocamera posizionata nella posizione di uno dei palmari. Quindi procedere con la pulizia del sistema di perfusione.
Posizionare il cuore cannulato in una camera di vetro maliziosa e collegare la cannula al sistema di perfusione. Fissare il cuore al fondo in silicone della camera all'apice ventricolare e agli atri. Per immobilizzare il cuore, spegnere la luce della stanza e iniettare lentamente la statina BLE attraverso la porta di iniezione per ridurre il movimento della superficie della soluzione.
Posizionare una copertura di vetro sopra la superficie epicardica. Questa parte della procedura viene normalmente eseguita al buio, ma viene eseguita alla luce. Per migliorare l'immagine video, spostare il sistema di imaging doppio sulla parte superiore del cuore.
Ora metti a fuoco le due fotocamere CMO sullo stesso campo visivo. Posizionare quindi le guide luminose per due lampade alogene con filtro di eccitazione. Colorare il cuore aggiungendo da 10 a 20 microlitri di colorante sensibile alla tensione RH 2 37 attraverso la porta di iniezione.
Quindi aggiungere 200 microlitri di strada 2:00 AM con onic F1 27 in una miscela uno a uno attraverso la porta delle trappole a bolle. Attendere circa 20 minuti per consentire la DS ificazione della strada alle 2:00 del mattino prima dell'inizio della mappatura. Ora fai una registrazione di prova.
Spegnere la pompa per superfusione per evitare movimenti sulla superficie della soluzione. Accendi le lampade alogene e registra otticamente da entrambe le telecamere. Quindi spegnere la spia di eccitazione.
Accendere la pompa per superfusione e controllare la qualità dei segnali ottici. Se il segnale è debole, tamponare il cuore con un'ulteriore RH 2 37 e strada 2:00 AM. Se c'è un artefatto di movimento, aggiungi ulteriori statine BLE per rimuovere il movimento con tutto in ordine. Procedere con l'esperimento pianificato e ripulire il sistema.
Al termine, il sistema di mappatura ottica panoramica è stato utilizzato per mostrare questa vista anteriore di un cuore di coniglio perfuso di Lang Endorf. In confronto, una ricostruzione della geometria del cuore mostra la stessa vista anteriore. La superficie epicardica non avvolta mostrata qui è codificata a colori per fase.
Il cuore stava subendo un episodio di aritmia appiccicosa da cinque punti intorno al rotore. Sono stati presentati i potenziali d'azione ottici. Qui in rosso c'è un fronte d'onda di attivazione che si propaga durante un ciclo di aritmia stabile ripetuta.
Il fronte d'onda ruota in senso orario attorno a una singolarità di fase sulla superficie anteriore del cuore. La ripolarizzazione è in blu trasparente per consentire la visualizzazione dei fronti d'onda sulla superficie posteriore. Il cuore è stato analizzato utilizzando il sistema di mappatura duale per mostrare la mappatura simultanea dei potenziali d'azione e dei transitori del calcio.
Una vista ravvicinata delle registrazioni da un sito mostra che i potenziali d'azione sono in blu e i transitori di calcio in rosso. Una serie di tracce di campioni è mostrata da una serie di siti equidistanti, come illustrato dai punti su questa vista anteriore. Questi dati sono stati raccolti con una risoluzione ottica di 200 micron per 200 micron per pixel.
Le implicazioni della terapia estendono la terapia di defibrillazione per le aritmie atriali e ventricolari 10 K perché possiamo visualizzare direttamente l'effetto di forti stimoli elettrici durante l'elettroterapia. Nessun metodo alternativo è in grado di farlo. Utilizzando questo metodo, sviluppiamo e convalidiamo una nuova terapia di sgonfiaggio indolore a basso voltaggio per la fibrillazione atriale e la tachicardia ventricolare.
Panoramica
Questo articolo descrive le procedure per condurre esperimenti di mappatura ottica nel cuore di coniglio perfuso di Langendorff utilizzando un sistema di imaging panoramico. Lo studio si concentra sulle proprietà elettrofisiologiche cardiache, inclusi la conduzione e la gestione del calcio.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Elettrofisiologia cardiaca
- Tecniche di mappatura ottica
- Aritmogenesi
Sfondo
- La mappatura ottica consente la registrazione simultanea di potenziali d'azione e transitori di calcio.
- Questo metodo fornisce informazioni sulla funzione cardiaca e le aritmie.
- I metodi tradizionali possono essere limitati da artefatti dovuti alla stimolazione elettrica.
- Lo studio utilizza un modello di cuore di coniglio perfuso di Langendorff.
Obiettivo dello studio
- Indagare sulla conduzione cardiaca, la ripolarizzazione e l'aritmogenesi.
- Analizzare la gestione del calcio nel miocardio.
- Fornire dati quantitativi sulle dinamiche di eccitazione e ripolarizzazione.
Metodi utilizzati
- Isolamento e perfusione retrograda del cuore di coniglio.
- Colorazione del miocardio con indicatori fluorescenti sensibili al voltaggio e al calcio.
- Registrazione di potenziali d'azione ottici utilizzando un sistema di mappatura ottica panoramico.
- Imaging duale simultaneo di potenziali d'azione ottici e transitori di calcio.
Risultati principali
- Dati quantitativi sulle caratteristiche spaziali e temporali del miocardio.
- Approfondimenti sui meccanismi delle aritmie e delle malattie cardiache.
- Dimostrazione dei vantaggi della mappatura ottica rispetto agli elettrocardi tradizionali.
Conclusioni
- La mappatura ottica è uno strumento potente per studiare l'elettrofisiologia cardiaca.
- Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sulle aritmie.
- Studi futuri possono sfruttare questo metodo per approfondimenti più dettagliati sulla funzione cardiaca.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Optical mapping in Langendorff-perfused rabbit hearts enables high-resolution, artifact-free visualization of cardiac electrophysiology, supporting mechanistic de-risking in arrhythmia target validation. This approach provides quantitative spatial-temporal data on action potentials and calcium transients, directly informing predictive confidence in preclinical models of ventricular and atrial arrhythmias. The method bridges discovery biology and translational research by enabling reproducible, scalable assessment of pro-arrhythmic liability and therapeutic response in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping reentrant wave dynamics and phase singularities during induced arrhythmias.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous voltage and calcium imaging to de-risk excitation-contraction coupling mechanisms.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying arrhythmogenic substrate vulnerability under controlled perfusion conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline electrophysiological and calcium handling phenotypes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through Langendorff perfusion control and dye-staining protocols.
- Scalability: Highlights screening readiness via panoramic and dual imaging systems capable of simultaneous multi-site optical recording.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses rabbit heart model with demonstrated similarity to human excitation-contraction coupling and arrhythmia wave patterns.
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through quantitative analysis of conduction, repolarization, and calcium handling during regular rhythm and arrhythmia.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing mechanistic insights into arrhythmia induction, maintenance, and termination.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, enabling iterative refinement of antiarrhythmic candidates based on electrophysiological and calcium handling profiles.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing rotor dynamics and action potential calcium transient relationships during arrhythmogenesis.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible optical signal acquisition with sufficient signal-to-noise ratio for spatial-temporal analysis.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of excitation and repolarization dynamics, enabling comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via disease-relevant arrhythmia models and calcium handling insights relevant to heart failure and metabolic disease.
- Enterprise Reuse: Frames the optical mapping system as a reusable platform for assessing multiple compounds or genetic modifications in a standardized perfused heart preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in arrhythmia mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of electrophysiological and calcium transient measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative arrhythmia liability data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac isolation, Langendorff perfusion, and fluorescent dye handling.
- Needs optical mapping systems with photo diode arrays or CMOS cameras, light sources, and perfusion pressure control.
- Demands cross-team standardization of staining protocols, excitation-contraction uncoupling, and signal acquisition parameters.
- Involves adaptation considerations for species-specific flow rates, optics, and dye loading when extending beyond rabbit hearts.
- Includes practical limitations such as dye photobleaching, motion artifact susceptibility, and the need for precise temperature and pH maintenance during experiments.
