Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le proprietà elettrofisiologiche cardiache come la conduzione, la ripolarizzazione, l'arritmogenesi e la gestione del calcio mediante tecniche di mappatura ottica nel cuore di coniglio perfuso secondo Langendorff. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto un cuore di coniglio integro e procedendo con una perfusione retrograda attraverso l'aorta. Il passo successivo della procedura consiste nell'esporre la superficie del cuore, abolire le contrazioni cardiache utilizzando un inibitore dell'accoppiamento eccitazione-contrazione, e colorare adeguatamente il miocardio mediante indicatori fluorescenti sensibili al voltaggio e al calcio.

Successivamente, vengono effettuate registrazioni di potenziali d'azione ottici da gran parte dell'epicardio ventricolare utilizzando il sistema di mappatura ottica panoramica. I segnali ottici vengono quindi mappati su una geometria 3D ricostruita della superficie epicardica del cuore. Durante questo passaggio, il potenziale d'azione ottico e il transiente del calcio possono essere registrati contemporaneamente utilizzando il sistema di imaging doppio non panoramico.

Questa procedura fornisce dati quantitativi sul miocardio spaziale e temporale, sull'eccitazione e sulla ripolarizzazione, nonché sulle caratteristiche congruenti della gestione del calcio, che possono essere analizzate durante il ritmo regolare così come nelle aritmie atriali e ventricolari. Ciao, mi chiamo Dr. Iger Eov. Sono professore di ingegneria biomedica presso la Washington University di St. Louis.

La tecnica ottica che presentiamo oggi è una tecnologia unica che offre numerosi vantaggi rispetto ai micro e microelettrogrammi tradizionali, poiché è in grado di registrare contemporaneamente decine, migliaia di potenziali d'azione e transitori di calcio. Inoltre, questa tecnologia è immune agli artefatti provocati dalla stimolazione elettrica e dalla defibrillazione, che distorcono fortemente i potenziali d'azione registrati mediante elettrogrammi. Inoltre, i transitori di calcio possono essere registrati soltanto con questa tecnica.

Non esiste alcuna alternativa. Questo metodo può contribuire a rispondere alle domande fondamentali nel campo dell'elettrofisiologia cardiaca, come i meccanismi di induzione, mantenimento e terminazione delle aritmie atriali e ventricolari potenzialmente letali, nonché la modellizzazione della funzione della conduzione e dell'accoppiamento eccitazione-costruzione in patologie come malformazioni cardiache congenite, malattie metaboliche e insufficienza cardiaca. Dopo aver preparato il coniglio per l'intervento chirurgico, eutanasia il coniglio con un cocktail di pentobarbitale sodico ed eparina.

Non appena il coniglio smette di rispondere a un riflesso del dolore, aprirne il torace ed estrarre il cuore e i polmoni. Praticare un'incisione all'estremità superiore dell'aorta ascendente, prima che tutti i rami dell'arco aortico vengano collegati alla pompa per avviare il flusso della soluzione di Tyro nel sistema di perfusione LRF non ricircolante. Montare rapidamente il cuore su una cannula aortica da 16 gauge collegata al sistema di perfusione LOR.

Svuotare l'aria dall'aorta e legare il cannula aortico una volta completata la perfusione. Non perdere tempo nell'aprire il pericardio. Quindi rimuovere il grasso polmonare, tracheale e circostante il cuore, nonché i tessuti connettivi.

È molto importante prevenire l'accumulo di liquido nel ventricolo sinistro, che potrebbe causare ischemia. Inserire quindi un tubo di drenaggio in silicone attraverso una vena polmonare e la valvola mitrale fino a raggiungere il ventricolo sinistro. A questo punto, spostare il cuore con la cannula nel sistema di perfusione Langendorff in ricircolo dotato di sistema di mappatura ottica.

Posizionare il cuore in una camera esagonale appositamente realizzata e collegare la cannula al sistema di perfusione. Monitorare la pressione aortica mediante un trasduttore di pressione e mantenerla intorno a 60 ± 5 millimetri di mercurio regolando la portata della pompa di perfusione. Mantenere il pH intorno a 7,35 ± 0,05.

Spegnere la luce della stanza e iniettare lentamente la soluzione madre di BLEs statina sensibile alla luce attraverso il porto di iniezione nel trappola di bolle d'aria situato sopra la cannula. Per raggiungere una concentrazione di 10 micromolare di BLEs statina, iniettare lentamente 0,1 millilitri di BLEs statina. Dopo ogni iniezione in bolo, attendere che la pressione si stabilizzi prima della successiva iniezione.

Posizionare gli array di fotodiodi o PDA a tre angoli equidistanti attorno al cuore. Quindi, su ciascun PDA, focalizzare l'immagine del cuore sul vetro smerigliato del piano dell'immagine. Regolare la posizione della cannula nella camera esagonale e di ciascun PDA finché il cuore non rientra nel campo visivo di tutti e tre i PDA.

Quindi scattare una foto di ciascuna immagine a fuoco sul vetro smerigliato. Iniettare lentamente da 10 a 20 microlitri di soluzione madre di D four Anep nella soluzione di perfusione attraverso il porto di iniezione nel trappola bolle d'aria. Attendere quindi tre minuti.

Successivamente, posizionare delicatamente l'elettrodo di stimolazione nel sito desiderato. In questo caso, viene posizionato al centro della vista anteriore del cuore. Iniziare a effettuare contemporaneamente la registrazione ottica dai PDAs.

Assicurarsi che non vi siano artefatti di movimento nel segnale ottico e che il rapporto segnale-rumore sia sufficiente per l'analisi successiva dei dati. Al termine, accendere le luci della stanza ed eseguire una documentazione fotografica del cuore scattando una fotografia ogni 10 gradi di rotazione da una posizione della telecamera corrispondente a quella di uno dei PDA. Procedere quindi con la pulizia del sistema di perfusione.

Posizionare il cuore cannullato in una camera di vetro trasparente e collegare la cannuetta al sistema di perfusione. Fissare il cuore al fondo in silicone della camera all'apice ventricolare e alle atria. Per immobilizzare il cuore, spegnere la luce della stanza e iniettare lentamente BLEs statin attraverso il porto di iniezione per ridurre il movimento della superficie della soluzione.

Posizionare un coperchio di vetro sopra la superficie epicardica. Questa parte della procedura viene normalmente eseguita al buio, ma in questo caso viene eseguita alla luce. Per migliorare l'immagine video, spostare il sistema di imaging doppio sopra il cuore.

Ora focalizzare le due telecamere CMO sullo stesso campo visivo. Successivamente posizionare le guide luminose per due lampade alogene con filtro di eccitazione. Colorare il cuore aggiungendo da 10 a 20 microlitri di colorante sensibile alla tensione RH 2 37 attraverso il porto di iniezione.

Quindi aggiungere 200 microlitri di road 2:00 AM con F1 27 onic in una miscela uno a uno attraverso il porto del trappolatore a bolle. Attendere circa 20 minuti per consentire la DS-ifazione del road 2:00 AM prima di iniziare la mappatura. Effettuare ora una registrazione di prova.

Spegnere la pompa di superfusione per evitare movimenti sulla superficie della soluzione. Accendere le lampade alogene ed effettuare una registrazione ottica da entrambe le telecamere. Successivamente, spegnere la luce di eccitazione.

Accendere la pompa di superfusione e verificare la qualità dei segnali ottici. Se il segnale è debole, ristainare il cuore con ulteriore RH 2 37 e road 2:00 AM. Se è presente un artefatto da movimento, aggiungere immediatamente ulteriore BLEs statin per eliminare il movimento, assicurandosi che tutto sia in ordine. Procedere con l'esperimento pianificato e pulire il sistema.

Al termine, il sistema di mappatura ottica panoramica è stato utilizzato per mostrare questa vista anteriore del cuore di coniglio Langendorf perfuso. Per confronto, una ricostruzione della geometria cardiaca mostra la stessa vista anteriore. La superficie epicardica srotolata mostrata qui è codificata a colori in base alla fase.

Il cuore stava subendo un episodio di aritmia tachicardica proveniente da cinque posizioni attorno al rotore. Sono stati presentati potenziali d'azione ottici. Qui in rosso è visibile un fronte di attivazione che si propaga durante un ciclo di aritmia ritmica stabile.

Il fronte d'onda ruota in senso orario attorno a una singolarità di fase sulla superficie anteriore del cuore. La repolarizzazione è in blu trasparente per permettere la visualizzazione dei fronti d'onda sulla superficie posteriore. Il cuore è stato analizzato utilizzando il sistema di mappatura doppia per mostrare la mappatura simultanea dei potenziali d'azione e dei transitori del calcio.

Una vista ravvicinata delle registrazioni provenienti da un sito mostra i potenziali d'azione in blu e il transitorio del calcio in rosso. Un insieme di tracce campione è mostrato proveniente da una serie di siti equidistanti, come rappresentato dai punti in questa vista anteriore. Questi dati sono stati raccolti con una risoluzione ottica di 200 micrometri per 200 micrometri per pixel.

Le implicazioni della terapia estendono la terapia di defibrillazione per le aritmie atriali e ventricolari da 10 K, poiché possiamo visualizzare direttamente l'effetto di stimoli elettrici intensi durante l'elettroterapia. Nessun metodo alternativo è in grado di fare ciò. Utilizzando questo metodo, abbiamo sviluppato e validato una nuova terapia di defibrillazione a basso voltaggio e indolore per la fibrillazione atriale e la tachicardia ventricolare.