Microiniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione genica in uno striato di cucciolo di topo

Prendiamo un cucciolo di topo geneticamente modificato che porta una cassetta STOP fiancheggiata da loxP che blocca l'espressione della proteina fluorescente rossa o RFP.

Fissare il cucciolo su un telaio stereotassico su misura e coprirlo con ghiaccio per mantenere l'anestesia.

Disinfettare il cuoio capelluto e contrassegnare lambda come punto di riferimento.

Allineare l'ago per iniezione alle coordinate striatali relative alla lambda e perforare il cranio.

Ritrarre l'ago sulla superficie del cranio, quindi inserirlo nella profondità desiderata.

Iniettare il vettore virale miscelato con colorante nello striato a una velocità controllata. Il vettore codifica per le proteine fluorescenti verdi o GFP e Cre ricombinasi.

Estrarre lentamente l'ago per evitare il riflusso della soluzione.

Rimuovi il cucciolo e consenti il recupero.

Nelle cellule striatali, il virus rilascia il suo genoma, consentendo l'espressione della Cre ricombinasi e della GFP. Cre asporta la cassetta STOP fiancheggiata da loxP, attivando l'espressione di RFP.

L'espressione simultanea di GFP e RFP conferma il successo della manipolazione genica.

Posiziona il cucciolo con il guanto nel vassoio per la testa e metti del ghiaccio