Concentrazione dei metaboliti a bassa densità Comunità planctoniche per Metabolomica ambientali utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare
7 aprile 2012
Un metodo per l'estrazione metabolita da parte delle comunità microbiche planctonici è presentato. Campionamento intera comunità si realizza mediante filtrazione su filtri appositamente preparati. Dopo liofilizzazione, acquoso-solubili metaboliti vengono estratti. Questo approccio consente per l'applicazione della metabolomica ambientali trans-omiche indagini di comunità microbiche naturali o sperimentali.
La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare offre diversi vantaggi distinti per la ricerca di metabolomica ambientale, ma è relativamente insensibile in questa procedura. Viene descritto un metodo di filtrazione per la concentrazione ed estrazione di metaboliti di comunità intere da sistemi platonici adatti alla NMR. Questo viene realizzato preparando innanzitutto in modo specifico i filtri per il prelievo dei campioni, rimuovendo le sostanze estraibili.
Il secondo passaggio della procedura consiste nel filtrare il campione, naturale o sperimentale, sui filtri. Il terzo passaggio della procedura consiste nel congelare rapidamente il materiale del campione ed estrarre i metaboliti. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'analizzare i campioni mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ed integrare i dati in modo appropriato.
In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano cambiamenti metabolici in campioni naturali lungo gradienti ambientali o in risposta a manipolazioni sperimentali, mediante approcci di metabolomica e transams. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la centrifugazione, è che l'intera comunità può essere campionata e sono possibili volumi di campione più grandi per campioni a bassa densità. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ambient metal mix, ad esempio come la microcrescita risponde ai cambiamenti ambientali. La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Stage e da me del mio laboratorio.
Iniziare questo protocollo posizionando i filtri in un becher Pyrex pulito da 500 millilitri utilizzando pinze. Coprire i filtri con acqua distillata per prerisciacquarli, agitando bene per evitare che i filtri si attacchino tra loro. Versare via l'acqua e ripetere il risciacquo due volte.
Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere 300 millilitri di acqua Milli Q nel becher e sterilizzare i filtri in autoclave. Una volta sterilizzati i filtri, versare via l'acqua Milli Q ed eseguire un triplo risciacquo dei filtri come in precedenza, utilizzando però acqua Milli Q.
Posizionare i singoli filtri su una superficie pulita e asciutta, come ad esempio della carta stagnola, utilizzando pinzette, e lasciarli asciugare a una temperatura ragionevole. Ad esempio, a 37 gradi oppure lasciandoli asciugare all'aria; a questo punto i filtri sono pronti per essere utilizzati al fine di dimostrare questo protocollo. Viene impiegato un manifold per filtrazione in acciaio inossidabile Millipore a tre posti, dotato di colonne di filtrazione da 25 millimetri per microanalisi con supporti in vetro e una pompa meccanica, utilizzando una tecnica asettica.
Posizionare un singolo filtro da 25 millimetri sulla base della colonna filtrante. Applicare la colonna e fissare l'apparato con una pinza. Caricare 15 millilitri di campione qui ottenuti da un microcosmo ad alto contenuto nutritivo sulla colonna.
Aprire la valvola di chiusura del collettore del filtro e accendere la pompa del filtro con una pressione delicata per minimizzare la rottura cellulare. Per campioni di densità più bassa, potrebbero essere necessarie aggiunte successive di acqua. Avere cura di non far asciugare eccessivamente il filtro per lunghi periodi tra un'aggiunta e l'altra di acqua.
Due, ridurre i sali paramagnetici residui dai campioni marini e un eventuale risciacquo con acqua dolce possono essere eseguiti. Una volta terminata la filtrazione, spegnere la pompa e lasciare la valvola aperta in modo che vi sia ancora una pressione negativa sotto il filtro. Rimuovere la pinza e la colonna del filtro con una mano.
Utilizzare pinzette pulite per afferrare il filtro. Piegate il filtro su se stesso senza formare pieghe, utilizzando l'altra mano. Usate il bordo di una provetta sterile da due millilitri per microcentrifuga per tenere premuto il filtro.
Posizionare il filtro nel tubo da due millilitri e rilasciarlo in modo che si apra con il lato del campione rivolto verso l'interno. Congelare immediatamente in azoto liquido per estrarre i metaboliti solubili in acqua. Liofilizzare prima i campioni per tutta la notte o per almeno 10 ore; dopo la liofilizzazione, aggiungere un pestello in acciaio inossidabile a ciascun tubo.
Aggiungere 750 microlitri di tampone standardizzato di fosfato di potassio e ossido di deuterio con standard DSS. Sonicare i campioni per cinque minuti a quattro gradi in un bagno ad ultrasuoni per rimuovere il materiale cellulare dal filtro. Rimuovere i filtri con pinzette pulite.
Disgregare le cellule utilizzando un mulino frantumatore a 1600 giri al minuto per cinque minuti. Successivamente, incubare a 65 gradi Celsius. Agitare su un agitatore da banco per 15 minuti.
Dopo l'incubazione, rimuovere il frantumatore metallico con pinzette pulite. Centrifugare il campione a 13.000 G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, prelevare il sopranatante e trasferirlo direttamente in un tubo per NMR per la spettroscopia NMR.
Caricare il campione nello spettrometro NMR qui. I campioni vengono analizzati su uno spettrometro Bruker DRX 500 dotato di sonda TXI con gradiente triassiale, operante a 298 Kelvin. Eseguire il bloccaggio, la taratura e la shimatura del magnete.
Ottenere spettri NMR 1D del protone utilizzando l'interfaccia top spin e metodi precedentemente descritti oppure utilizzare altri software di interfaccia per spettrometro secondo necessità. In questo caso, gli spettri sono stati acquisiti con soppressione dei segnali residui dell'acqua mediante la sequenza impulsionale Watergate con un tempo di ripetizione di 1,2 secondi. Nell'esempio presente, sono stati raccolti 128 transitori per ogni campione.
Trasferire le directory dei dati NMR su un computer personale dotato del software NMR pipe. Elaborare i dati grezzi, impostare il segnale del DSS come riferimento a zero ppm e quindi correggere manualmente la fase degli spettri. Digitalizzare i dati spettrali mediante binnatura utilizzando il pacchetto FT two B disponibile pubblicamente sul sito web di commercio elettronico.
Altri strumenti software come RNMR o Atomics possono essere utilizzati anche per la binnizzazione. I dati possono essere normalizzati rispetto al segnale totale o a quello del DSS per mostrare le variazioni proporzionali del segnale tra i campioni. I dati in uscita possono ora essere utilizzati per analisi statistiche successive, come l'analisi delle componenti principali o PCA, mediante pacchetti software gratuiti come R, qui mostrato.
Di seguito è riportato un esempio di spettri NMR del protone ottenuti utilizzando la procedura descritta. Gli spettri provengono da due diversi punti temporali di un esperimento in microcosmo e mostrano differenze evidenti dovute all'attività metabolica delle alghe. Lo spettro del quarto giorno mostra una notevole abbondanza di picchi, in particolare nell'intervallo tra 3 e le 4:00 PM, rispetto al campione del primo giorno.
Questi picchi possono essere attribuiti agli zuccheri prodotti da diatomee fiorite all'interno del microcosmo. In un esperimento simile, un grafico dei punteggi PCA derivato dalla curvatura in Mr.Spectra, che mostra i primi due componenti principali, è stato utilizzato per confrontare la crescita di comunità planctoniche naturali in acqua marina artificiale e naturale. Questo approccio statistico riduce i dati multidimensionali a un formato più semplice, in questo caso bidimensionale, rivelando in modo immediato la struttura dei punti dati sottostanti vicini tra loro.
Gli assi, singolarmente o entrambi, sono qui più simili. È possibile osservare chiare differenze metaboliche tra i due trattamenti. I dati di questo esperimento sono stati utilizzati per eseguire un'analisi multi-omics.
Combinando i dati di NMR con quelli genomici, la composizione della comunità microbica basata sull'elettroforesi in gradiente denaturante di gel di geni 18S e 16S-R-RNA mostra anche pattern distinti di comunità microbiche tra microcosmi di acqua di mare naturale e artificiale. Tale corrispondenza tra metaboloma e genoma provenienti da sistemi naturali dimostra l'utilità di questo approccio. Nel seguire questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una tecnica appropriata per minimizzare la contaminazione.
Altri metodi, come l'analisi della creazione a livelli omici, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio in che modo il microbioma si correla con determinati metaboliti.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per l'estrazione di metaboliti da comunità planctoniche microbiche mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. La procedura prevede la filtrazione su filtri appositamente preparati, la liofilizzazione e l'estrazione successiva di metaboliti solubili in acqua, facilitando studi di metabolomica ambientale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Metabolomica ambientale
- Ecologia microbica
- Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare
Sfondo
- L'estrazione dei metaboliti è fondamentale per lo studio delle comunità microbiche.
- La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare fornisce informazioni sulla composizione dei metaboliti.
- I metodi di filtrazione aumentano la concentrazione di metaboliti dai campioni.
- Questo approccio può essere applicato sia a sistemi microbici naturali che sperimentali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'estrazione di metaboliti da comunità planctoniche microbiche.
- Permettere un'analisi dettagliata dei metaboliti mediante spettroscopia NMR.
- Fare progressare il campo della metabolomica ambientale.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dei filtri per la rimozione di sostanze estraibili.
- Filtrazione dei campioni microbici su filtri preparati.
- Liofilizzazione del materiale campione.
- Estrazione di metaboliti solubili in acqua per l'analisi.
Risultati principali
- Il metodo concentra ed estrae con successo i metaboliti dalle comunità microbiche.
- La spettroscopia NMR analizza in modo efficace i metaboliti estratti.
- L'approccio è applicabile sia a campioni naturali che sperimentali.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei profili metabolici delle comunità microbiche.
Conclusioni
- Questo metodo migliora lo studio della metabolomica microbica.
- Fornisce un quadro di riferimento per future ricerche in metabolomica ambientale.
- Ulteriori applicazioni possono portare a nuove conoscenze sulle interazioni e le funzioni microbiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La metabolomica ambientale affronta sfide di sensibilità nello studio di comunità microbiche a bassa densità, limitando l'applicabilità della NMR nei flussi di lavoro della scoperta precoce. Questo metodo di concentrazione basato sulla filtrazione consente il profilo non mirato di metaboliti da sistemi planctonici, supportando la generazione di ipotesi in ecologia microbica e l'esplorazione traslazionale di biomarcatori. Migliorando la rilevabilità dei metaboliti, l'approccio aumenta la sicurezza predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico per applicazioni nella salute ambientale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso il rilevamento delle variazioni dei metaboliti a livello dell'intera comunità microbica in risposta a stimoli ambientali.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati per la preparazione dei filtri e la lisi, al fine di ridurre la variabilità tecnica nell'estrazione dei metaboliti.
- Valore strategico: Supporta la selezione del portafoglio progettuale mediante il rilevamento riproducibile di biomarcatori metabolici associati a percorsi di stress o adattamento microbico.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi NMR successive concentrando i metaboliti solubili in acqua da campioni a bassa densità.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione del saggio mediante liofilizzazione ed estrazione con tampone fosfato di potassio, migliorando la riproducibilità tra diverse prove.
- Valore strategico: Migliora la prontezza per l'analisi in studi sugli effetti dei composti in modelli di co-colture microbiche o comunità sintetiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie permettendo la correlazione tra metaboloma e genoma in microcosmi di acqua marina naturale e artificiale.
- Valore operativo: Supporta la continuità traslazionale attraverso l'integrazione multi-omica, collegando gli spettri dei metaboliti ai dati sulla composizione genomica della comunità.
- Valore strategico: Aiuta nelle decisioni di avanzamento con adeguata gestione del rischio identificando firme metaboliche costanti lungo gradienti ambientali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta permettendo la verifica di ipotesi in sistemi microbici, prosegue con lo screening mediante estrazione standardizzata di metaboliti e supporta la ricerca traslazionale attraverso l'allineamento di dati multi-omici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici mediante il rilevamento delle variazioni dei metaboliti nelle comunità planctoniche in diversi trattamenti sperimentali.
- Screening: Fornisce prontezza per saggi e risultati quantitativi attraverso le concentrazioni di metaboliti rilevabili mediante NMR dopo filtrazione e lisi.
- Analisi: Genera dati spettrali adatti ad analisi statistiche come l'analisi delle componenti principali (PCA), consentendo il confronto tra condizioni e il riconoscimento di schemi.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso la corrispondenza tra metaboloma e genoma in sistemi naturali, favorendo l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di filtrazione ed estrazione riutilizzabile, applicabile a diversi modelli microbici acquatici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle risposte ai metaboliti microbici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità grazie al pretrattamento con filtro e ai passaggi di lisi automatizzati.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione fornendo profili di metaboliti riproducibili per la riduzione del rischio biologico.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio mediante variazioni rilevabili nei metaboliti associate a fenotipi di crescita o stress microbico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di filtrazione, liofilizzazione e preparazione dei campioni per NMR per evitare contaminazioni e garantire il recupero dei metaboliti.
- Presuppone l'accesso a spettrometri NMR dotati di capacità di soppressione del segnale dell'acqua e di software per l'elaborazione e la suddivisione in intervalli degli spettri.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la manipolazione dei filtri, i tamponi di estrazione e i protocolli di normalizzazione dei dati, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Richiede adattamenti in relazione alla densità variabile dei campioni, rendendo necessarie filtrazioni sequenziali o aggiustamenti del volume per comunità a bassa abbondanza.
- Comprende limitazioni pratiche, come l'interferenza di sali paramagnetici residui nei campioni marini, che richiedono fasi opzionali di risciacquo per mantenere la qualità spettrale.
