Name: Concentrazione dei metaboliti a bassa densità Comunità planctoniche per Metabolomica ambientali utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Scopri un metodo di filtrazione per concentrare ed estrarre metaboliti da comunità planctoniche microbiche per analisi NMR. Questa tecnica consente studi di metabolomica ambientale su campioni naturali e sperimentali.

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Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Grants-in-Aid per la ricerca scientifica per contestare la ricerca esplorativa (JK), e della Ricerca Scientifica (A) (JK e SM) dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia, Giappone . Una borsa di studio RIKEN FPR (RCE) offerto un sostegno supplementare. Gli autori esprimono la loro gratitudine a Drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama e Mami Okamoto per l&#39;assistenza tecnica con la NMR e analisi statistiche.

1. Preparazione filtro per rimuovere estraibili <ol><li> Utilizzare 25 mm di diametro 0,22 micron pori di dimensioni Durapore filtri PVDF idrofilo (Millipore). Mettere filtri in un bicchiere pulito da 500 ml Pyrex con una pinzetta. Pre-risciacquo tre volte con acqua distillata. Agitare così come si risciacquo per evitare che i filtri si attacchino tra loro. Aggiungere 300 ml Milli-Q (Millipore) o equivalente di alta qualità dell'acqua. Autoclavare per facilitare la rimozione completa estraibili dai filtri. </li><li> Eliminare il Milli-Q e di nuovo triple lavare i filtri, questa volta con Milli-Q. Utilizzo dei filtri singoli pinzette posto su una superficie asciutta e pulita (come il foglio di alluminio) e sia asciutto ad una temperatura ragionevole (per esempio 37 ° C) o aria secca. I filtri sono ora pronti per l'uso. </li></ol> 2. Filtrazione di materiale campione <ol><li> Per dimostrare questo protocollo, Millipore in acciaio inox a 3 posti collettore filtro con 25 mm di microanalisi colonne filtro con supporti in vetroe una pompa meccanica vengono utilizzati. Usando una tecnica asettica, inserire un singolo da 25 mm filtro sulla base della colonna filtro, applicare la colonna e fissarlo insieme. </li><li> Caricare 15 ml di campione alla colonna, aprire l'otturatore sul collettore del filtro, e accendere la pompa. Filtrare sotto una leggera pressione per minimizzare la rottura delle cellule (&lt;5 kPa). Altre pompe, come la mano o una pompa peristaltica può essere adattato a questo protocollo. Per i campioni a bassa densità, successive aggiunte di acqua può essere necessaria, non lasciare andare il filtro a secco per un periodo prolungato di tempo tra le aggiunte di acqua. </li><li> Per i campioni marini, dopo aver filtrato il campione, è possibile eseguire un risciacquo acqua dolce opzionale per ridurre gli ioni paramagnetici residui nel campione e sul filtro. Questo può aiutare con più precisa messa a punto del magnete dello spettrometro. Basta aggiungere delicatamente una piccola quantità di acqua e filtrare attraverso il vostro campione prelevato alla fine. </li><li> Una volta che il filtraggio è finito, spegnere la pompa, e lasciare la valvola di Open quindi c'è ancora pressione negativa sotto il filtro. Rimuovere il morsetto e la colonna filtro. </li><li> Con una mano, utilizzare pinzette pulite a prendere piede del filtro. Piegare il filtro tra sé, ma non piega. Con l'altra mano usare il labbro di un sterile da 2 ml provetta a tenere premuto il filtro. Rilasciare le pinzette poi usarli per ri-afferrare entrambi i bordi del filtro. Regrip a 45 ° angolo di piega. </li><li> Posizionare il filtro nel tubo da 2 ml e il rilascio in modo che si apre con il lato rivolto verso l'interno del campione. È possibile inserire fino a due filtri nel tubo da 2 ml sterile microcentrifuga in questo modo. Se si utilizzano due filtri, si sovrappongono garantire il meno possibile. Immediatamente congelare (almeno -30 ° C). </li></ol> 3. Estrazione di acquosa solubili metaboliti <ol><li> Liofilizzare i campioni durante la notte o per almeno 10 ore. </li><li> Dopo la liofilizzazione, aggiungere un frantoio in acciaio inox ad ogni provetta (Tokken). Aggiungere 750 microlitri di potassio standardizzatotampone fosfato NMR in ossido di deuterio (2 H&gt; 90%) con 2,2-dimetil-2-silapentane-5-solfonato (DSS) standard (KPI; 38,3 mM KH 2 PO 4, il 61,7 mM K 2 HPO 4, DSS 0,1 mM, pH 7,0, 90% D 2 O) 2. </li><li> Sonicare i campioni per 5 minuti a 4 ° C in un sonicatore acqua (Bioruptor, Diagenode) per rimuovere il materiale cella dal filtro. Rimuovere i filtri con pinzette pulite. </li><li> Frantumare le cellule utilizzando un frantoio a mulino (1600 rpm) per 5 minuti. </li><li> Incubare a 65 ° C con agitazione (1400 rpm) su un banco agitatore (Eppendorf) per 15 minuti. </li><li> Rimuovere il maiale metallo con pinzette pulite, e centrifugare il campione a 13.000 g per 5 minuti. </li><li> Disegnare il sopranatante direttamente ad un tubo NMR per spettroscopia NMR. </li></ol> 4. Spettroscopia NMR e Analisi dei Dati <ol><li> Caricare il campione in uno spettrometro NMR (qui, un Bruker DRX-500 equipaggiato con spettrometroSonda TXI con tre assi gradiente controllato da un computer che esegue XWIN-NMR). </li><li> Ottenere 1D 1 H spettri NMR con adeguati metodi precedentemente pubblicati 2,15 dal XWIN-NMR interfaccia. Nel presente studio 1 H NMR sono stati registrati su un sistema operativo DRX-500 spettrometro a 500,03 MHz a 298 K. acqua segnali residui sono state soppresse dalla sequenza di impulsi Watergate, con un tempo di ripetizione di 1,2 s. 128 transitori sono stati raccolti per ottenere 32.000 punti dati per spettro. </li><li> Trasferire le directory dei dati NMR ad un PC installato il software NMRPipe 16. Elaborare i dati grezzi e DSS set a 0 di riferimento ppm quindi manualmente eliminare gli spettri. Digitalizzazione dei dati spettrali in un insieme di valori discreti, integrando o 'categorizzazione' con software come rNMR, Automics, o utilizzando il pacchetto FT2B pubblicamente disponibili sul sito web ECOMICS ( <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> ) 3,17. In thè, ad esempio, gli spettri sono stati integrati tra 0,5 e 10,5 ppm oltre 0.032 regioni ppm integrale con ECOMICS e normalizzati al DSS sia o intensità del segnale totale. I dati in uscita possono ora essere utilizzati per la valle analisi statistiche come analisi delle componenti principali (PCA) con pacchetti di software libero come R 18. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Un esempio di spettri 1 H NMR ottenuti utilizzando i metodi di cui sopra sono mostrati nella Figura 1. Questi campioni, da due punti di tempo di un esperimento microcosmo mostrano differenze evidenti a causa di alghe attività metaboliche. Il giorno 4 spettro mostra picchi di abbondanza considerevole, in particolare nell'intervallo 3-4 ppm rispetto al giorno 1 campione. Questi picchi possono essere attribuiti agli zuccheri prodotti dal fiore diatomee nel microcosmo. In un esperimento simile a confronto la crescita delle comunità naturali plancton in acqua di mare artificiale o naturale, approcci statistici sale come principale trama analisi punteggio della componente (PCA) derivato da spettri NMR binned può essere usato per mostrare evidenti differenze metaboliche tra i due trattamenti (Fig. 2), mentre le trame possono identificare i picchi di carico all'interno del spettri che forma la distribuzione dei dati . Tali risultati possono essere confrontati con i dati provenienti da altri livelli omiche, come da metodi di fingerprinting genomici (Fig. 3). Questi picchi NMR può essere interrogato singolarmente (ad esempio presso l'BMRB; <a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a> ) 19, o spettri intera possono essere analizzati statisticamente (per esempio con SpinAssign a <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search</a> ) 2. In questo esempio, le differenze tra i trattamenti erano dovuti ad un abbondanza di picchi nella regione di zuccheri (3,39 ppm a 4,04 ppm) degli spettri di metaboliti naturali della comunità plancton, e numerosi picchi caratteristici delle comunità artificiali con acqua di mare sono stati provvisoriamente identified come lattato e formiato con SpinAssign. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rappresentativa spettri 1 H NMR ottenuti da campioni trattati con questa procedura. I campioni sono stati prelevati prima del Microcosmo (giorno 1) e durante (giorno 4) una fioritura di diatomee intenso. Esperimenti NMR sono state eseguite su uno strumento Bruker DRX-500 con segnali normalizzati al altezza picco dello standard interno (DSS; 0 ppm). <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Analisi delle componenti principale (PCA) plot punteggio spettri NMR cestinate da metabolomes delle comunità microbiche naturalmente derivati ​​planctonici coltivate in microcosmi con diamanti naturali (acqua di mare aperto) o artificiali (cerchi neri). Chiare differenze metaboliche può essere osservato nel grafico a dispersione. Una trama caricamento da una tale analisi può essere utilizzato per identificare picchi distinti di importanzail sistema, questi picchi può essere ulteriormente analizzato come necessario. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un esempio di multi-omiche analisi NMR combinazione con i dati genomici. Composizione della comunità sulla base di elettroforesi su gel gradiente denaturante 18S (a sinistra) e 16S (a destra) geni rRNA dai campioni stessi analizzati nella Figura 2 mostra anche diversi modelli di comunità microbiche tra i diamanti naturali (aperti) e artificiale (cerchi neri) microcosmi di acqua di mare. Tale corrispondenza tra metaboloma genoma e dai sistemi naturali dimostra l'utilità di questo approccio.

<ol><li>Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+metabolomics%3A+a+critical+review+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives.</a> Metabolomics. 5, 3-21 (2008).</li>
<li>Chikayama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+indices+for+simultaneous+large-scale+metabolite+detections+for+a+single+NMR+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum.</a> Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).</li>
<li>Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rNMR%3A+open+source+software+for+identifying+and+quantifying+metabolites+in+NMR+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Chem%22%5BJournal%5D)">rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra.</a> Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+gut+microbes+modulate+human+metabolic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).</li>
<li>Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+exploration+of+metabolic+and+genomic+diversity+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice.</a> BMC Genomics. 10, 568(2009).</li>
<li>Fukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacteria+can+protect+from+enteropathogenic+infection+through+production+of+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate.</a> Nature. 469, 543-547 (2011).</li>
<li>Kikuchi, J., Hirayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+stable+isotope+labeling+of+higher+plants+for+a+hetero-nuclear+multi-dimensional+NMR-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics.</a> Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).</li>
<li>Martin, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+top-down+systems+biology+view+of+microbiome-mammalian+metabolic+interactions+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model.</a> Mol. Syst. Biol. 3, 112(2007).</li>
<li>Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+approach+to+lipid+profiling+of+mycobacteria+using+2D+HSQC+NMR+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps.</a> J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).</li>
<li>Fukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+characterization+of+bacterial+metabolic+dynamics+with+a+novel+profiling+technique%2C+real-time+metabolotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping.</a> PloS ONE. 4, e4893(2009).</li>
<li>Date, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+monitoring+approach+for+metabolic+dynamics+in+microbial+ecosystems+using+stable-isotope-labeling+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies.</a> J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).</li>
<li>Nakanishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+omics+approach+identifies+nutrition-mediated+microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions.</a> J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).</li>
<li>Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogeochemical+controls+and+feedbacks+on+ocean+primary+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production.</a> Science. 281, 200-207 (1998).</li>
<li>Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+aquatic+organisms%3A+the+new+%27omics%27+on+the+block%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Ecol.+Prog.+Ser%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block.</a> Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).</li>
<li>Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+semipolar+solvent+system+as+a+step+toward+heteronuclear+multidimensional+NMR-based+metabolomics+for+13C-labeled+bacteria%2C+plants%2C+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals.</a> Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).</li>
<li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMRPipe%3A+A+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+UNIX+pipes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes.</a> J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automics%3A+an+integrated+platform+for+NMR-based+metabonomics+spectral+processing+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis.</a> BMC Bioinformatics. 10, 83(2009).</li>
<li>The R Project for Statistical Computing. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> (2010).</li>
<li>Eldon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).</li>
<li>Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+polar+and+semipolar+plant+metabolites+throughout+extraction+processes+using+a+combined+solution-state+and+high-resolution+magic+angle+spinning+NMR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach.</a> Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

L&#39;estrazione filtrazione e metabolita metodo illustrato qui permette per la biomassa microbica planctoniche da raccogliere in quantità sufficiente per metabolomica NMR. Mentre solo di estrazione acquosa-solubili metaboliti utilizzando KPI e 1D 1 H NMR è dimostrata, altri solventi da estrazione e approcci spettroscopici possono essere utilizzati. Un esempio utile è l&#39;uso di metanolo deuterato come solvente semi-polare, che ha dimostrato di produrre spettri NMR superiore da campioni eterogenei ed è meno...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> 0,22 micron idrofile Durapore filtri PVDF, 25 mm </td><td> Millipore </td><td> GVWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Holder microanalisi Filter, 25 mm, supporto di vetro poroso </td><td> Millipore </td><td> XX1002500 </td><td></td></tr><tr><td> 3-posto collettore, 47 mm, in acciaio inox </td><td> Millipore </td><td> XX2504735 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Wako </td><td> 164-04295 </td><td></td></tr><tr><td> Ossido di deuterio, 2 H&gt; 90% </td><td> Campridge Isotope Laboratoties </td><td> DLM-4 </td><td></td<html> &gt; </tr><tr><td> DSS </td><td> Fluka </td><td> 92754 </td><td></td></tr><tr><td> Automill </td><td> Tokken </td><td> TK-AM4 </td><td> Frantoi in acciaio inox incluse </td></tr><tr><td> Thermomixer confort </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 000.011 </td><td></td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuum evaporatore </td><td> EYELA </td><td> CVE-3100 </td><td></td></tr><tr><td> NMR </td><td> Bruker </td><td> DRX-500 con 5 mm TXI sonda </td><td></td></tr><tr><td> Spectral strumento di binning </td><td> Originariamente sviluppato </td><td> FT2DB </td><td> <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> </td></tr><tr><td> Annotazione strumento di Metabolita e database </td><td> Originariamente sviluppato </td><td> SpinAssign </td><td>= Nmr_search &quot;&gt; http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search </td></tr></tbody></table>

concentrazione dei metaboliti a bassa densità comunità planctoniche per metabolomica ambientali utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Metabolomica ambientale è un settore emergente che sta promuovendo una nuova comprensione in come gli organismi rispondere e interagire con l&#39;ambiente e l&#39;altro a livello biochimico 1. Risonanza magnetica nucleare (NMR) è una delle varie tecnologie, compreso il gas cromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), con la promessa di un notevole per tali studi. I vantaggi di NMR sono che è adatto per le analisi non mirati, fornisce informazioni strutturali e spettri può essere interrogato in maniere quantitativi e statistici nei confronti di banche dati disponibili di recente dei singoli spettri metabolita 2,3. Inoltre, i dati NMR spettrali possono essere combinati con dati provenienti da altri livelli omiche trascrittomica (ad esempio, la genomica), per fornire una comprensione più completa delle risposte fisiologiche di taxa gli uni agli altri e l&#39;ambiente 4,5,6. Tuttavia, NMR è meno sensibile rispetto ad altre tecniche metabolomica, rendendo difficile apply ai sistemi microbici naturali dove campioni di popolazione possono essere le concentrazioni a bassa densità e basso rispetto al metabolita metaboliti ben definite e facilmente estraibili fonti, quali tessuti interi, biofluidi o cellulo-culture. Di conseguenza, i pochi studi ambientali diretti metabolomica di microbi eseguiti fino ad oggi sono stati limitati alla cultura-based o facilmente definito ad alta densità ecosistemi come host-simbionti sistemi, costruiti co-colture o manipolazioni dell&#39;ambiente intestinale in cui l&#39;etichettatura isotopi stabili possono essere inoltre utilizzati per migliorare segnali NMR 7,8,9,10,11,12. Metodi che facilitano la concentrazione e la raccolta dei metaboliti ambientali a concentrazioni adatte NMR mancano. Dal recente attenzione è stata data alle metabolomica ambientali degli organismi nell&#39;ambiente acquatico, in cui è mediata gran parte del flusso di energia e materiali da parte della comunità planctoniche 13,14, abbiamo sviluppato un metodo per la concentrazionezione e l&#39;estrazione di tutta la comunità-metaboliti microbici planctonici dai sistemi di filtrazione. Disponibili in commercio idrofile poli-1 ,1-difluoroethene (PVDF), i filtri sono appositamente trattati per rimuovere completamente estraibili, che possono altrimenti apparire come contaminanti nelle analisi successive. Questi filtri trattati vengono poi usati per filtrare i campioni ambientali o sperimentale di interesse. Filtri contenenti il materiale umido campione sono liofilizzato e acquosa metaboliti solubili vengono estratti direttamente per la spettroscopia NMR convenzionale utilizzando un tampone fosfato di potassio standardizzato di estrazione 2. I dati derivano da questi metodi possono essere analizzati statisticamente per identificare i modelli significativi, o integrato con gli altri livelli omiche per la comprensione globale della comunità e il funzionamento dell&#39;ecosistema.

Un metodo per l&#39;estrazione metabolita da parte delle comunità microbiche planctonici è presentato. Campionamento intera comunità si realizza mediante filtrazione su filtri appositamente preparati. Dopo liofilizzazione, acquoso-solubili metaboliti vengono estratti. Questo approccio consente per l&#39;applicazione della metabolomica ambientali trans-omiche indagini di comunità microbiche naturali o sperimentali.

Concentrazione dei metaboliti a bassa densità Comunità planctoniche per Metabolomica ambientali utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare

La metabolomica ambientale è un campo emergente che sta promuovendo una nuova comprensione di come gli organismi rispondano e interagiscano con l'ambiente e tra di loro...

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare offre diversi vantaggi distinti per la ricerca di metabolomica ambientale, ma è relativamente insensibile in questa procedura. Viene descritto un metodo di filtrazione per la concentrazione ed estrazione di metaboliti di comunità intere da sistemi platonici adatti alla NMR. Questo viene realizzato preparando innanzitutto in modo specifico i filtri per il prelievo dei campioni, rimuovendo le sostanze estraibili.Il secondo passaggio della procedura consiste nel filtrare il campione, naturale o sperimentale, sui filtri. Il terzo passaggio della procedura consiste nel congelare rapidamente il materiale del campione ed estrarre i metaboliti. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'analizzare i campioni mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ed integrare i dati in modo appropriato.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano cambiamenti metabolici in campioni naturali lungo gradienti ambientali o in risposta a manipolazioni sperimentali, mediante approcci di metabolomica e transams. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la centrifugazione, è che l'intera comunità può essere campionata e sono possibili volumi di campione più grandi per campioni a bassa densità. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ambient metal mix, ad esempio come la microcrescita risponde ai cambiamenti ambientali. La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Stage e da me del mio laboratorio.Iniziare questo protocollo posizionando i filtri in un becher Pyrex pulito da 500 millilitri utilizzando pinze. Coprire i filtri con acqua distillata per prerisciacquarli, agitando bene per evitare che i filtri si attacchino tra loro. Versare via l'acqua e ripetere il risciacquo due volte.Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere 300 millilitri di acqua Milli Q nel becher e sterilizzare i filtri in autoclave. Una volta sterilizzati i filtri, versare via l'acqua Milli Q ed eseguire un triplo risciacquo dei filtri come in precedenza, utilizzando però acqua Milli Q.Posizionare i singoli filtri su una superficie pulita e asciutta, come ad esempio della carta stagnola, utilizzando pinzette, e lasciarli asciugare a una temperatura ragionevole. Ad esempio, a 37 gradi oppure lasciandoli asciugare all'aria; a questo punto i filtri sono pronti per essere utilizzati al fine di dimostrare questo protocollo. Viene impiegato un manifold per filtrazione in acciaio inossidabile Millipore a tre posti, dotato di colonne di filtrazione da 25 millimetri per microanalisi con supporti in vetro e una pompa meccanica, utilizzando una tecnica asettica.Posizionare un singolo filtro da 25 millimetri sulla base della colonna filtrante. Applicare la colonna e fissare l'apparato con una pinza. Caricare 15 millilitri di campione qui ottenuti da un microcosmo ad alto contenuto nutritivo sulla colonna.Aprire la valvola di chiusura del collettore del filtro e accendere la pompa del filtro con una pressione delicata per minimizzare la rottura cellulare. Per campioni di densità più bassa, potrebbero essere necessarie aggiunte successive di acqua. Avere cura di non far asciugare eccessivamente il filtro per lunghi periodi tra un'aggiunta e l'altra di acqua.Due, ridurre i sali paramagnetici residui dai campioni marini e un eventuale risciacquo con acqua dolce possono essere eseguiti. Una volta terminata la filtrazione, spegnere la pompa e lasciare la valvola aperta in modo che vi sia ancora una pressione negativa sotto il filtro. Rimuovere la pinza e la colonna del filtro con una mano.Utilizzare pinzette pulite per afferrare il filtro. Piegate il filtro su se stesso senza formare pieghe, utilizzando l'altra mano. Usate il bordo di una provetta sterile da due millilitri per microcentrifuga per tenere premuto il filtro.Posizionare il filtro nel tubo da due millilitri e rilasciarlo in modo che si apra con il lato del campione rivolto verso l'interno. Congelare immediatamente in azoto liquido per estrarre i metaboliti solubili in acqua. Liofilizzare prima i campioni per tutta la notte o per almeno 10 ore; dopo la liofilizzazione, aggiungere un pestello in acciaio inossidabile a ciascun tubo.Aggiungere 750 microlitri di tampone standardizzato di fosfato di potassio e ossido di deuterio con standard DSS. Sonicare i campioni per cinque minuti a quattro gradi in un bagno ad ultrasuoni per rimuovere il materiale cellulare dal filtro. Rimuovere i filtri con pinzette pulite.Disgregare le cellule utilizzando un mulino frantumatore a 1600 giri al minuto per cinque minuti. Successivamente, incubare a 65 gradi Celsius. Agitare su un agitatore da banco per 15 minuti.Dopo l'incubazione, rimuovere il frantumatore metallico con pinzette pulite. Centrifugare il campione a 13.000 G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, prelevare il sopranatante e trasferirlo direttamente in un tubo per NMR per la spettroscopia NMR.Caricare il campione nello spettrometro NMR qui. I campioni vengono analizzati su uno spettrometro Bruker DRX 500 dotato di sonda TXI con gradiente triassiale, operante a 298 Kelvin. Eseguire il bloccaggio, la taratura e la shimatura del magnete.Ottenere spettri NMR 1D del protone utilizzando l'interfaccia top spin e metodi precedentemente descritti oppure utilizzare altri software di interfaccia per spettrometro secondo necessità. In questo caso, gli spettri sono stati acquisiti con soppressione dei segnali residui dell'acqua mediante la sequenza impulsionale Watergate con un tempo di ripetizione di 1,2 secondi. Nell'esempio presente, sono stati raccolti 128 transitori per ogni campione.Trasferire le directory dei dati NMR su un computer personale dotato del software NMR pipe. Elaborare i dati grezzi, impostare il segnale del DSS come riferimento a zero ppm e quindi correggere manualmente la fase degli spettri. Digitalizzare i dati spettrali mediante binnatura utilizzando il pacchetto FT two B disponibile pubblicamente sul sito web di commercio elettronico.Altri strumenti software come RNMR o Atomics possono essere utilizzati anche per la binnizzazione. I dati possono essere normalizzati rispetto al segnale totale o a quello del DSS per mostrare le variazioni proporzionali del segnale tra i campioni. I dati in uscita possono ora essere utilizzati per analisi statistiche successive, come l'analisi delle componenti principali o PCA, mediante pacchetti software gratuiti come R, qui mostrato.Di seguito è riportato un esempio di spettri NMR del protone ottenuti utilizzando la procedura descritta. Gli spettri provengono da due diversi punti temporali di un esperimento in microcosmo e mostrano differenze evidenti dovute all'attività metabolica delle alghe. Lo spettro del quarto giorno mostra una notevole abbondanza di picchi, in particolare nell'intervallo tra 3 e le 4:00 PM, rispetto al campione del primo giorno.Questi picchi possono essere attribuiti agli zuccheri prodotti da diatomee fiorite all'interno del microcosmo. In un esperimento simile, un grafico dei punteggi PCA derivato dalla curvatura in Mr.Spectra, che mostra i primi due componenti principali, è stato utilizzato per confrontare la crescita di comunità planctoniche naturali in acqua marina artificiale e naturale. Questo approccio statistico riduce i dati multidimensionali a un formato più semplice, in questo caso bidimensionale, rivelando in modo immediato la struttura dei punti dati sottostanti vicini tra loro.Gli assi, singolarmente o entrambi, sono qui più simili. È possibile osservare chiare differenze metaboliche tra i due trattamenti. I dati di questo esperimento sono stati utilizzati per eseguire un'analisi multi-omics.Combinando i dati di NMR con quelli genomici, la composizione della comunità microbica basata sull'elettroforesi in gradiente denaturante di gel di geni 18S e 16S-R-RNA mostra anche pattern distinti di comunità microbiche tra microcosmi di acqua di mare naturale e artificiale. Tale corrispondenza tra metaboloma e genoma provenienti da sistemi naturali dimostra l'utilità di questo approccio. Nel seguire questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una tecnica appropriata per minimizzare la contaminazione.Altri metodi, come l'analisi della creazione a livelli omici, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio in che modo il microbioma si correla con determinati metaboliti.

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