Inibizione dell'attività neuronale e sua rilevazione mediante elettrofisiologia in un ratto

Cominciamo con un ratto anestetizzato fissato in una cornice stereotassica con il cranio esposto.

Utilizzando i punti di riferimento anatomici, la bregma e la lambda, localizza il collicolo superiore, una struttura cerebrale profonda responsabile dell'elaborazione delle informazioni visive.

Trapano per creare un lembo osseo, rimuoverlo e applicare un tampone per mantenere idratato il cervello esposto.

Posizionare un gruppo iniettore costituito da una micropipetta con un elettrodo collegato a una microsiringa.

La micropipetta contiene una soluzione di neurotrasmettitore inibitorio per sopprimere l'eccitabilità neuronale mentre l'elettrodo registra contemporaneamente l'attività neuronale.

Abbassare l'iniettore nel collicolo superiore e coprire la superficie esposta con agar fuso per prevenire la disidratazione.

La luce presente lampeggia verso l'occhio per stimolare i neuroni ed evocare potenziali d'azione sincronizzati.

Iniettare il neurotrasmettitore, che si lega ai suoi recettori e innesca l'afflusso di ioni cloruro.

Questo afflusso iperpolarizza il potenziale di membrana, sopprimendo così i potenziali d'azione.

Man mano che la concentrazione del neurotrasmettitore diminuisce nel tempo, l'attività neuronale si riprende.

Per preparare le pipette per iniezione di registrazione, per prima cosa, tirare un capillare di 7 centimetri con un diametro esterno di 1 millimetro. Per un modello verticale cop 720 o un'unità simile, impostare il riscaldatore su 18 e il solenoide su uno. Successivamente, indossando i guanti, rompere manualmente la punta per fare un'apertura e verificare al microscopio che il diametro interno sia compreso tra 30 e 40 micrometri. Misuralo con il righello del mirino. Produrrà un'impedenza relativamente bassa da 0,3 a 0,6 megaohm.

Quindi, dall'estremità non affusolata, inserire un filo d'argento nella pipetta lungo circa 7 centimetri e lasciare da 1 a 2 centimetri che pendono dalla pipetta. Piegare questo filo in eccesso ortogonalmente al capillare. Quindi, prendi un ago ipodermico calibro 30 e applica l'adesivo di plastica flessibile sull'asta. Quindi inserire lentamente l'ago nella pipetta il più lontano possibile.

Aggiungere altro adesivo per creare una tenuta alla giunzione tra la pipetta e l'ago. Con la punta della pipetta rivolta verso l'alto, lasciare asciugare il gruppo per circa 12 ore. Dopo aver anestetizzato e messo il ratto in una cornice stereotassica, applicare un unguento oftalmico, radergli la testa.

Dopo aver applicato un anestetico locale e confermato un piano chirurgico di anestesia, procedere con l'incisione del cuoio capelluto lungo la mediana utilizzando una lama di bisturi numero 10. Questo esporrà le suture coronali e sagittali. Quindi, utilizzando una spatola chirurgica, identificare i riferimenti anatomici lambda e bregma.

Regolare la posizione della testa in modo che questi punti di riferimento siano livellati sullo stesso piano orizzontale. Quindi azzerare un puntatore rigido fine come un tubo di vetro sulla bregma. Quindi, regola la posizione del tubo in una posizione di interesse utilizzando le coordinate del bregma.

Usa un pennarello per disegnare un quadrato attorno all'area di destinazione per la craniotomia. Ora, con il trapano chirurgico sterilizzato, rimuovete lentamente l'osso lungo i segni. Inizia esercitando la minor pressione possibile e mantieni il trapano in movimento per evitare danni ai tessuti indotti dalla testa dovuti all'attrito.

Quando l'osso è diventato sottile, rimuovere con cura la sezione quadrata con una pinzetta. Non è necessario rimuovere la dura madre poiché l'asta di iniezione vi penetrerà. Andando avanti, mantieni la corteccia esposta irrigata con liquido cerebrospinale. Preparare l'iniezione riempiendo prima una siringa da 5 a 10 microlitri con olio minerale. Successivamente, preparare il farmaco di interesse con un colorante in soluzione fisiologica. Qui, lo 0,5% di Chicago Sky Blue viene miscelato con 300 micromolari di GABA.

Ora, riempire la pipetta per iniezione caricando prima una siringa da 1 millilitro con la soluzione preparata, quindi utilizzando la siringa per caricare la pipetta. Quando si rimuove la siringa, mantenere una leggera pressione sullo stantuffo, in modo che il vuoto non rimuova la soluzione dall'iniettore. Verificare la fuoriuscita di liquido in eventuali punti di perdita. Tamponare il liquido in eccesso e ricontrollare la presenza di perdite.

Collegare ora la micro siringa con olio minerale all'iniettore. Quindi rimuovere la soluzione in eccesso con una garza. Controllare la punta di iniezione. Dovrebbe essere possibile far scorrere piccole gocce di soluzione attraverso di esso. In caso contrario, è bloccato o perde. Ora, montare saldamente l'iniettore su un sistema di micropompa. Quindi spostare la posizione dell'iniettore alle coordinate target e abbassare l'elettrodo al collicolo superiore, che può essere identificato attraverso la registrazione dei potenziali evocati visivi.

Mentre l'elettrodo è abbassato, applicare una piccola pressione positiva applicando una bassa velocità di iniezione per evitare l'intasamento. Interrompere l'iniezione quando la struttura è raggiunta. Dopo aver inserito l'iniettore, coprire la corteccia esposta con agar caldo per evitare l'essiccazione.

Dopo il posizionamento finale dell'elettrodo, attendere 30 minuti per consentire la stabilizzazione del tessuto che circonda l'elettrodo. Quindi iniettare da 400 a 800 nanolitri di soluzione a una velocità di 40 nanolitri al minuto, fino all'inattivazione dell'attività neuronale nel collicolo superiore. L'elettrodo dovrebbe mostrare una riduzione dei picchi durante l'iniezione della soluzione inibitoria.