Consegna del gene subpiale nel midollo spinale del topo per valutare l'espressione genica

Prendi un topo anestetizzato, rasagli la schiena e disinfetta la pelle.

Incidere la pelle, staccare i muscoli dalle vertebre e ritrarli con le pinze.

Perforare le lamine vertebrali per creare crepe, quindi rimuovere i frammenti ossei per esporre la dura madre, la membrana esterna del midollo spinale.

Usando un ago, crea un'apertura durale e perfora la pia madre sottostante per entrare nello spazio subpiale per l'accesso diretto al tessuto spinale.

Prendere un ago di somministrazione contenente una sospensione di virus adeno-associato ricombinante che trasporta un gene che esprime la proteina fluorescente e iniettare la sospensione.

Estrarre l'ago, suturare i muscoli e la pelle e lasciare che il topo si riprenda.

Il virus si lega ai recettori dei neuroni e delle cellule gliali e viene endocitosizzato.

Una volta all'interno del nucleo, il virus innesca l'espressione genica per produrre proteine fluorescenti.

Il modello di consegna genica subpial è ora pronto per valutare l'espressione genica target nel midollo spinale.

Inizia anestetizzando correttamente l'animale per l'intervento chirurgico. Qui viene utilizzato l'isoflurano. Assicurarsi che non ci sia una risposta di pizzicamento della zampa prima di procedere. Quindi coprire gli occhi con un unguento oftalmico. Quindi, radere la schiena dell'animale con le tosatrici e pulire la pelle con clorexidina al 2%.

Se devono essere eseguite iniezioni subpiali lombari, tagliare la pelle sovrastante le vertebre da T8 a L1 con un bisturi. E poi usa le forbici per staccare il muscolo paravertebrale dalle vertebre spinali T10 a T12. Monta l'animale in un telaio stereotassico standard utilizzando morsetti spinali per topi. Quindi, usa un trapano dentale per radere entrambi i lati della lamina delle vertebre da T10 a T12 fino a quando non compaiono crepe.

Quindi, usa una pinza per rimuovere i frammenti ossei incrinati ed esporre la superficie dorsale del midollo spinale lombare. La dura madre è ora visibile. Utilizzare un ago in acciaio inossidabile calibro 30 per praticare un'incisione da 1 a 2 millimetri nella dura.

È importante tagliare con cura la dura madre per evitare lesioni alla membrana pia sottostante.

Ora, afferra il bordo della dura dura tagliata con una pinza ed estendi l'apertura della dura dura fino a 5 millimetri. Montare l'ago penetrante pia calibro 34 e l'ago di iniezione calibro 36 sui bracci Z di due manipolatori XYZ separati utilizzando supporti capillari in vetro.

Quindi, utilizzare una micro siringa da 50 microlitri collegata a un tubo PE-10 o PE-20 per caricare il virus AAV9-UBI-GFP. Dopo che il virus è stato caricato, collegare l'estremità del tubo all'ago per iniezione. Successivamente, mentre guardi attraverso un cannocchiale da dissezione chirurgico impostato su un ingrandimento da 8 a 10x, usa il braccio X per abbassare l'ago penetrante nella pia a una profondità di 1 millimetro. Mantenere l'angolo dell'ago penetrante da 5 a 10 gradi, rispetto alla superficie del tessuto.

Dopo aver aperto il pia, usa il braccio a X per rimuovere l'ago penetrante pia dallo spazio subpiale. Annota il sito penetrato utilizzando un punto di riferimento, come un vaso sanguigno. Spostare i bracci X, Y e Z del secondo manipolatore per posizionare la punta dell'ago per iniezione caricato con virus AAV9 nel sito penetrato da pia.

Quindi, dopo aver inserito la punta dell'ago per iniezione di circa 0,5 millimetri nello spazio subpiale, utilizzare il braccio Z per sollevare la pia di circa 0,3 millimetri, quindi utilizzare il braccio X per continuare a far avanzare l'ago orizzontalmente nello spazio subpiale. Far avanzare l'ago fino a quando non entra nello spazio subpiale a una profondità di circa 2 o 3 millimetri.

Quindi, utilizzare la micro siringa da 50 microlitri per iniettare il virus AAV9-UBI-GFP nello spazio subpiale. Rimuovere l'ago per iniezione dallo spazio subpiale, al termine dell'iniezione di AAV9-UBI-GFP. Chiudere il muscolo e la pelle utilizzando la sutura in monofilamento di fluoro e le clip chirurgiche. Lasciare che l'animale si riprenda su un termoforo prima di riporlo in una gabbia pulita.