Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura
July 9th, 2011
Approfittando dei progressi nello sviluppo fluoroforo e tecnologia di imaging, un metodo semplice di Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue è stato ideato per visualizzare le prime interazioni tra virus e cellule.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di marcare in fluorescenza il virus della dengue per studi microscopici. Preparare i tamponi necessari e purificare il virus della dengue con un cuscino di saccarosio, ricostituire il colorante a flusso Amy React Alexa e il virus della dengue nel tampone di etichettatura. Etichetta il virus della dengue con un centinaio di micromolari di flusso Alexa.
Morire per un'ora e interrompere la reazione di marcatura con il reagente secondario. Purificare l'etichetta del virus della dengue attraverso una colonna di esclusione delle dimensioni. Retitrizzare il virus marcato mediante test di placca e stimare il grado di marcatura mediante test di immunofluorescenza.
Ciao, sono Sam Jang dei Laboratori Nazionali DSO che lavora nel laboratorio del Dr.Wee nel programma di malattie infettive emergenti dopo la scuola di specializzazione in medicina NUS. Oggi ti mostrerò come marcare in modo fluorescente il virus Denki con il colorante antinfluenzale Amy Reactive Alexa per gli studi di imaging. Alexa, l'influenza muore, hanno superiore per la stabilità e sono meno sensibili al pH rispetto alla dieta comune come la fluoresceina e la rumina, rendendoli ideali per gli studi sull'assorbimento cellulare e il trasporto endosomiale del virus.
Il virus della dengue etichettato con il difetto di Alexa faciliterà la comprensione della patogenesi della dengue. Quindi iniziamo. Prima della reazione di etichettatura, preparare un nuovo tampone di marcatura e interrompere il reagente secondo il protocollo scritto e purificare il virus della dengue con un cuscino di saccarosio, aggiungere un volume appropriato del virus della dengue purificato al tampone di marcatura in una provetta da microcentrifuga per raggiungere una concentrazione di 300 milioni di unità di formazione per millilitro.
Questo può essere ingrandito proporzionalmente. Per l'etichettatura in batch di virus. Ricostituire il colorante per pavimenti Alexa liofilizzato a un millimolare nel tampone di marcatura appena prima della reazione di etichettatura.
Ridurre al minimo l'esposizione alla luce da questo passaggio in poi. A scopo dimostrativo, il colorante per pavimenti Alexa non sarà protetto dalla luce di 800 microlitri di un millimolare. Alexa flow die al virus della dengue diluito mentre mescola delicatamente con la punta micro Pipet.
Incubare per un'ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce mista da delicate inversioni ogni 15 minuti dopo un'ora, centrifugare brevemente le provette. Un 800 microlitro della sottoregione, fissando delicatamente con la micropipetta, incubare per un'altra ora a temperatura ambiente. Protetto dalla luce effettua con inversioni delicate ogni 15 minuti.
Nel frattempo, equipara la colonna di purificazione a 25 millilitri di tampone HNE. Dopo un'ora di incubazione, applicare il virus marcato sulla colonna e iniziare a raccogliere il flusso. Riempire la colonna con il buffer HNE.
Una volta che tutto il virus marcato è entrato nella matrice, scartare i primi 2,5 millilitri di flusso e raccogliere i successivi due millilitri della frazione virale marcata. Ecor e ha visto il virus marcato purificato a meno 80 gradi Celsius. Determinare il titolo del virus marcato mediante test della placca.
In un esperimento tipico, si dovrebbe osservare un calo inferiore di dieci volte del titolo del virus. Dopo la marcatura, è necessario eseguire un test di immunofluorescenza per valutare il grado di marcatura. Per fare ciò, enumerare le cellule virali utilizzando un emocitometro e un volume appropriato di cellule per i mezzi di crescita per ottenere una densità di 50.000 cellule per millilitro.
Vedere un millilitro di cellule virali per pozzetto in una piastra a quattro pozzetti contenente un coperchio di vetro sterile. Dormire. Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Togliere la piastra dall'incubatrice e aspirare il supinatore dal pozzetto, infatti, dalle cellule con circa un MOI del virus marcato in un volume di cento microlitri per 10 minuti a 37 gradi Celsius.
Rimuovere l'inoculo e lavare le cellule con 0,5 millilitri di tampone PBS per pozzetto. Ripetere questa procedura altre due volte. Fissare le celle con 200 microlitri di 3% per multi altezza per pozzetto a temperatura ambiente per 30 minuti.
Lavare le cellule tre volte con 0,5 millilitri di tampone PBS per pozzetto. Alalizzare le celle con la soluzione di purificazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere il coperchio dal pozzo di sonno utilizzando una pinza fine.
Scaricare il liquido in eccesso DPing il bordo del coperchio. Scivolare contro un bianco di carta. Posizionare il lato della cella del coperchio.
Dormi su 25 microlitri di anticorpi della proteina dengue e su un pezzo di profumo. Incubare per un'ora in camera umida a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Quindi, trasferire il vetrino coprioggetto su una piastra a sei pozzetti e aggiungere due millilitri di tampone di lavaggio per olio.
Aspirare il supinato. Ripetere questi passaggi di lavaggio altre due volte dopo l'ultimo lavaggio. Rimuovere il vetrino coprioggetto dal pozzetto usando fp fine.
Scaricare il liquido in eccesso immergendo il bordo del coperchio. Infilarlo contro una salvietta di carta. Posizionare il lato della cella del coperchio.
Dormi su 25 microlitri di pavimento Alexa per otto otto anticorpi secondari anti-topo su un pezzo di profumo. Incubare per 45 minuti in una camera umida a temperatura ambiente al riparo dalla luce dopo che l'incubazione è completata, trasferire il coperchio in una piastra a sei pozzetti e lavare le celle tre volte con due millilitri di tampone di lavaggio Per ogni lavaggio dopo l'ultimo lavaggio. Rimuovere il vetrino coprioggetto dal pozzetto e sciacquare una volta in acqua ionizzata.
Scolare il liquido in eccesso immergendolo contro una carta. Montare il vetrino coprioggetto su una luce da microscopio con otto microlitri di soluzione di montaggio delicata. Lasciare che la soluzione di montaggio imposti l'aria notturna di quattro gradi Celsius.
Il campione è ora pronto per essere visualizzato con un microscopio a fluorescenza o confocale. Posizionare una piccola goccia di olio da immersione sulla superficie del coperchio e fissare il microscopio. Far scorrere il microscopio.
Regolare il tavolino fino a quando l'obiettivo del microscopio non viene a contatto con l'olio da immersione. Per un'immagine chiara, spegni le luci ambientali utilizzando il software Zes Zen. Fare clic sul rubinetto oculare per osservare direttamente il campione attraverso l'oculare del microscopio.
Trova un riempimento con celle e regola la messa a fuoco. Ora passa alla modalità di acquisizione. Per ridurre al minimo la diafonia tra le cadute floreali, seleziona tracce separate per Alexa piano 4 8 8 e finito quattro.
Coloranti e acquisizioni impostate per l'eccitazione e la rilevazione sequenziale. Regolare il guadagno di potenza e l'offset del laser per assicurarsi che l'immagine non sia sovra o sottoesposta. Cattura l'immagine e analizza un'area di interesse utilizzando la funzione di colocalizzazione.
Il coefficiente di sovrapposizione può essere utilizzato per stimare il grado di marcatura del virus della dengue da parte del colorante Alexa Flo. Un semplice test di immunofluorescenza è stato eseguito su cellule virali e il grado di marcatura può essere stimato dalla colocalizzazione del virus marcato Con la proteina anti e, la colorazione anti anticorpo copre il coefficiente di sovrapposizione da 0,65 a 0,8, suggerendo che circa il 65-80% delle varianze sono state marcate con il colorante per pavimenti Alexa. Affinché la procedura di etichettatura abbia successo, è importante preparare il tampone di etichettatura e iniziare a infuriare da capo e ricostituire il digest da pavimento Alexa prima dell'etichettatura.
La concentrazione del colorante da utilizzare può essere ulteriormente ottimizzata in base alle proprie esigenze. Questo metodo di marcatura dell'orizzonte del virus della dengue può potenzialmente essere adattato per marcare altri virus. Quindi questo è tutto.
Grazie per l'osservazione e buona fortuna per il tuo esperimento di etichettatura.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per l'etichettatura fluorescente del virus dengue utilizzando Alexa Fluor per l'analisi microscopica. L'approccio permette la visualizzazione delle prime interazioni tra il virus e le cellule ospiti.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Virologia
- Microscopia a fluorescenza
- Biologia cellulare
Sfondo
- Il virus dengue è un importante problema di salute globale.
- Comprendere le interazioni virus-cellula è cruciale per sviluppare strategie antivirali.
- L'etichettatura fluorescente migliora la visualizzazione di queste interazioni.
- I progressi nelle tecnologie di imaging facilitano studi dettagliati.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'etichettatura del virus dengue.
- Visualizzare le interazioni tra il virus dengue e le cellule ospiti.
- Migliorare la comprensione delle prime fasi dell'infezione virale.
Metodi utilizzati
- Preparazione dei buffer necessari per l'etichettatura.
- Purificazione del virus dengue utilizzando un cuscinetto di saccarosio.
- Ricostituizione del colorante Alexa Fluor nel buffer di etichettatura.
- Etichettatura del virus con una concentrazione specifica di colorante.
Risultati principali
- Etichettatura fluorescente di successo del virus dengue.
- Visualizzazione delle interazioni virus-cellula al microscopio.
- Valutazione dell'efficienza di etichettatura attraverso il test di immunofluorescenza.
- Rideterminazione del virus etichettato utilizzando il test della placca.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un modo semplice ed efficace per etichettare il virus dengue.
- L'etichettatura fluorescente aiuta nello studio delle interazioni virus-ospite.
- Questa tecnica può essere applicata ad altri studi virali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Direct fluorescent labeling of dengue virus with Alexa Fluor enables precise visualization of virus-cell interactions, supporting early-stage mechanistic studies in infectious disease research. This capability enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for antiviral and vaccine development. The method's compatibility with live virus and quantitative imaging strengthens its value across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of virus entry and trafficking mechanisms in host cells.
- Supports biological de-risking by clarifying early infection events relevant to pathogenesis.
- Facilitates functional target validation through visualization of labeled virus interactions.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized approach for preparing fluorescently labeled virus for imaging-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of labeling efficiency via immunofluorescence and plaque assays.
- Enables scalable batch labeling suitable for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of antiviral compound effects on virus-cell entry and trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by preserving virus infectivity post-labeling.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of intervention strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative imaging readouts.
- Facilitates biomarker alignment through colocalization analysis of viral and cellular markers.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis-driven studies, assay development, and translational research on viral pathogenesis.
- Discovery Biology: Advances mechanistic understanding of virus-host interactions through direct visualization and quantitative colocalization.
- Screening: Delivers reproducible, labeled virus preparations for imaging-based screening of antiviral candidates.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as overlap coefficients and infectivity titers for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional virus for use in disease-relevant cellular models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable protocol for labeling other enveloped viruses in diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage virology research.
- Operational Value: Standardizes virus labeling and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and vaccine candidates based on quantitative imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-quality imaging platforms and analytical software for colocalization studies.
- Demands rigorous buffer preparation and dye handling to ensure reproducibility and minimize cytotoxicity.
- Adaptable to other enveloped viruses with protocol optimization for specific viral systems.
- Dependent on maintaining virus viability and labeling efficiency for downstream applications.
