Name: Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Impara a etichettare il virus Dengue con Alexa Fluor per la microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente di visualizzare le interazioni precoci tra virus e cellule ospiti, facilitando lo studio della patogenesi virale.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Consiglio Nazionale delle Ricerche, Singapore.

1. Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue <ol><li> Prima che la reazione di marcatura, purificare virus della dengue con cuscino di saccarosio e preparare i reagenti necessari e le attrezzature, come indicato nel protocollo. </li><li> Preparare fresca 0,2 M tampone bicarbonato di sodio, pH 8,5 (tampone etichettatura), e 1,5 M tampone idrossilammina, pH 8.3 (fermata reagente), poco prima di etichettatura e filtro sterilizzare con filtri per siringa 0.2μm. </li><li> Diluire a circa 3x10 8 unità placca formando (PFU) di depurata virus della dengue in 1 ml di etichettatura tampone in una provetta 2 ml. Questo può essere scalata proporzionalmente per l'etichettatura lotto di virus. </li><li> Ricostituire il liofilizzato Alexa Fluor 594 (AF594) esteri succinimidile a 1 mm di etichettatura tampone immediatamente prima della reazione di marcatura. Fluorocromi altro dal Alexa Fluor colorante serie può essere utilizzato in base alle proprie esigenze. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce a partire da questo passo. </li><li> Aggiungere 100μl del colorante AF594 1mm a virus diluito mescolando delicatamente con la punta della pipetta. </li><li> Incubare la miscela di reazione etichettatura a temperatura ambiente per 1 ora al buio. Miscelare inversioni dolce ogni 15 minuti. </li><li> Spin brevemente il tubo in una centrifuga da tavolo e aggiungere 100μl di reagente stop alla miscela di reazione mescolando delicatamente con la punta della pipetta. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per un'altra ora al buio. Miscelare inversioni dolce ogni 15 minuti. </li></ol> 2. Purificante Alexa Fluor etichettati virus della dengue <ol><li> Nel frattempo, equilibrare la colonna di purificazione con tampone di scelta. In questo esperimento, un PD-10 colonna è equilibrata con 25 ml di tampone HNE (Hepes 5 mm, 150 mm di NaCl, 0,1 mm EDTA), pH 7,4, prima dell'uso. </li><li> Applicare il virus etichettati per la parte superiore della colonna e iniziare a raccogliere le flow-through, una volta che il virus entra nella matrice etichettato. Riempire la colonna con tampone HNE una volta che tutti i virus etichettato è entrato nella matrice. Scartare il primo di 2,5 ml flow-through e raccogliere i prossimi 2 ml di virus frazione etichettati. </li><li> Aliquota e memorizzare purificata AF594 virus della dengue etichettati a -80 ° C, lontano da fonti di luce. </li></ol><ol><li> Scongelare uno aliquota e determinare il titolo del virus etichettato con il saggio della placca prima di utilizzare il lotto di virus etichettati. </li><li> Semi di 5x10 4 per bene di cellule Vero, coltivate in M-199 terreno di coltura, in un 4-pozzetti con un coprioggetto sul fondo di ben un giorno prima dell'infezione. </li><li> Rimuovere il surnatante cultura in bene e infettare le cellule con molteplicità di infezione di 1 del virus etichettati in volume 100μl (diluito in M-199 terreno di mantenimento, come richiesto) per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il inoculums e lavare i coprioggetti due volte in 1xPBS. </li><li> Fissare le cellule nel 3% paraformalydehyde per 30 minuti. </li><li> Lavare i coprioggetti 3 volte in 1xPBS. </li><li> Permeabilize le cellule con una soluzione di permeabilizzazione contenente saponina 0,1% e il 5% BSA in 1xPBS per 30 minuti. </li><li> Incubare le cellule con diluito centrifugazione-sopranatante chiarificato di 3H5 cultura anticorpi monoclonali ibridomi per 1 ora in camera umida, al riparo dalla luce. </li><li> Lavare i coprioggetti 3 volte in tampone di lavaggio (1xPBS contenente cloruro di calcio 1mm, cloruro di magnesio 1 mM e 0,1 saponina%). </li><li> Incubare le cellule con AF488 anti-topo IgG, 1:100 diluito in soluzione permeabilizzazione, per 45 minuti in camera umida, al riparo dalla luce. </li><li> Lavare i coprioggetti 3 volte in tampone di lavaggio e risciacquo, una volta in acqua deionizzata. </li><li> Tamponare il bordo del coprioggetti contro un tovagliolo di carta per drenare l'acqua in eccesso e montare su vetrino con 8μl Mowiol 4-88 DABCO contenente 2,5%. </li><li> Lasciare che la soluzione di montaggio per impostare notte a 4 ° C prima di visualizzare utilizzando un microscopio confocale Zeiss. Acquisizioni sequenziale deve essere eseguito eccitante fluoroforo alla volta e il passaggio tra i rivelatori in concomitanza. </li><li> Le immagini sono poi analizzate per la co-localizzazione delle proteine ​​e degli anticorpi colorazione con il virus etichettato con il software LSM Zen Zeiss per stimare il grado di etichettatura. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati Un esempio del rendimento del virus dengue marcato con colorante AF594 è illustrato nella figura 2. Normalmente, a meno di 10 volte cadere dal titolo iniziale dovrebbe essere osservate le seguenti etichette di successo. Tuttavia, va notato che tutti i tamponi devono essere preparati freschi per l'etichettatura per avere successo e Alexa Fluor esteri succinimidile deve essere utilizzato immediatamente dopo la ricostituzione come idrolizzano in acidi liberi reattivi in soluzioni acquose 8. Successivamente, il virus etichettato deve essere controllato per fluorescenza sufficiente prima dell'uso negli esperimenti. Un semplice test di immunofluorescenza è stato fatto su cellule Vero e il grado di etichettatura può essere definita sulla base dei co-localizzazione del virus etichettati con anti-E colorazione delle proteine ​​anticorpali. SeverAl cellule sono state esaminate e una tipica immagine confocale è mostrata in Figura 3. Co-localizzazione di analisi delle immagini utilizzando il software LSM Zen dimostrato sovrapposizione coefficienti che variano dal 0,65-0,8, il che suggerisce che circa il 65 l'80% dei virioni sono stati etichettati con il colorante. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura schema 1.Overall raffigurante la Alexa Fluor etichettatura tintura di procedura virus della dengue. In primo luogo, i buffer pertinenti e virus dengue purificato sono preparati. Il Alexa Fluor colorante è ricostituito e ha aggiunto al virus dengue diluito in tampone di etichettatura. La reazione è allora fermato dopo 1 ora con l'aggiunta di reagente di arresto. Successivamente, il virus marcato è purificata attraverso una colonna di esclusione dimensioni per rimuovere colorante libero. Infine, il virus etichettato è ri-titolato mediante test placca e testati per fluorescenza. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Il numero medio di virioni vitali (pfu / ml) su un determinato dosaggio placca prima e dopo l'AF594 etichettatura. Un'aliquota del virus AF594 etichettato dengue è scongelato e ri-titolato con il saggio della placca e si vede in genere meno di 10 volte caduta da il titolo di partenza. Le barre di errore indicano la deviazione standard di duplicati. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Co-localizzazione di AF594 etichette con le proteine ​​del virus dengue E su cellule Vero. Cellule coltivate su vetrini del giorno precedente sono stati infettati con AF594 dengue etichettate MOI di 1 per 10 minuti a 37 ° C. Le cellule sono state successivamente fissa e marcato con anticorpi anti-E, ed esaminati per colocalizzazione della proteina E (verde) e AF594 etichettatura (rosso). Segnali fluorescenti sono state visualizzate sotto ingrandimento 63x con Zeiss LSM 710 microscopio confocale. Barra di scala è 10μm. Giallo indicare le aree di colocalizzazione, come mostrato nel riquadro.

<ol><li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &amp, Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Protein+Color+Palette%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li>
<li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+dengue+virus%3A+implications+for+flavivirus+organization%2C+maturation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li>
<li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li>
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<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li>
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</ol>

Anche se AF594 colorante è stato utilizzato in questo rapporto, una vasta gamma di fluorofori nella serie Alexa Fluor succinimidile esteri è disponibile con la chimica etichettatura simili. Questo potrebbe estendere l&#39;applicazione dell&#39;etichettatura di là di imaging. Citometria a flusso può essere usato come alternativa alla microscopia confocale per valutare il grado di etichettatura per fluorofori che può essere eccitato e individuate dalla macchina FACS. Alexa Fluor coloranti sono...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Idrossilammina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Idrossido di sodio </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 esteri succinimidile </td><td> Sonde molecolari, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 colonna </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4 pozzetti </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrino da microscopio </td><td> Vela Marca </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> Ibridomi 3H5 </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1 Base </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> DABCO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga da tavolo </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Per preparare M-199 terreno di coltura, aggiungere 50 ml di FBS, 5 ml di piruvato di sodio e 5 ml di aminoacidi non essenziali a 500 ml di M-199, filtro sterile. Per preparare M-199 terreno di mantenimento, aggiungere 15 ml di FBS, 5 ml di piruvato di sodio e 5 ml di aminoacidi non essenziali a 500 ml di M-199, filtro sterile.

visualizzazione virus dengue attraverso alexa fluor etichettatura

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Gli eventi presto l&#39;interazione tra virus e cellule possono avere un&#39;influenza profonda sul risultato di infezione. Determinare i fattori che influenzano questa interazione potrebbe portare a una migliore comprensione della patogenesi della malattia e quindi influenzare vaccino terapeutico o di progettazione. Quindi, lo sviluppo di metodi per sondare questa interazione potrebbe essere utile. Più recenti progressi della fluorofori sviluppo 1-3 e tecnologia di imaging 4 può essere sfruttato per migliorare le nostre attuali conoscenze sulla patogenesi dengue e quindi aprire la strada per ridurre i milioni di dengue che si verificano ogni anno. Il virus dengue ha un involucro esterno costituito da un&#39;impalcatura di 90 busta glicoproteina (E) dimeri che proteggono il serbatoio nucleocapside, che contiene un singolo filamento positivo di RNA del genoma 5. Le subunità proteiche identiche sulla superficie del virus può quindi essere etichettato con un colorante reattivo ammina e visualizzati tramite microscopia a immunofluorescenza. Qui, presentiamo un semplice metodo di etichettatura dei virus della dengue con Alexa Fluor succinimidile estere colorante sciolto direttamente in un buffer di bicarbonato di sodio che ha dato virus altamente vitali dopo etichettatura. Non esiste una procedura standardizzata per l&#39;etichettatura dei virus vivo e protocollo del produttore esistente per l&#39;etichettatura delle proteine ​​di solito richiede la ricostituzione di colorante in dimetilsolfossido. La presenza di dimetilsolfossido, anche in piccole quantità, in grado di bloccare l&#39;infezione produttiva da virus e anche indurre citotossicità delle cellule 6. L&#39;esclusione dell&#39;uso di dimetilsolfossido in questo protocollo così ridotto questa possibilità. Alexa Fluor coloranti hanno fotostabilità superiore ed è meno sensibile al pH rispetto ai coloranti comuni, come la fluoresceina e rodamina 2, che li rende ideali per gli studi sulla captazione cellulare e il trasporto endosomali del virus. La coniugazione di Alexa Fluor colorante non ha influenzato il riconoscimento dei virus della dengue etichettati da virus-specifici anticorpi ed i suoi recettori putativi in cellule ospiti 7. Questo metodo potrebbe avere applicazioni utili in studi virologici.

Approfittando dei progressi nello sviluppo fluoroforo e tecnologia di imaging, un metodo semplice di Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue è stato ideato per visualizzare le prime interazioni tra virus e cellule.

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

Gli eventi iniziali dell'interazione tra virus e cellula possono influenzare profondamente l'esito dell'infezione. Determinare i fattori che...

L'obiettivo generale di questo esperimento è etichettare fluorescentemente il virus della dengue per studi microscopici. Preparare i tamponi necessari e purificare il virus della dengue con un cuscino di saccarosio; ricostituire il colorante Amy React Alexa Flow e il virus della dengue nel tampone di etichettatura. Etichettare il virus della dengue con cento micromoli di Alexa Flow.Incubare per un'ora e arrestare la reazione di marcatura con il reagente secondario. Purificare il virus della dengue marcato mediante una colonna a esclusione dimensionale. Rietitrare il virus marcato mediante saggio di placche e stimare il grado di marcatura mediante saggio di immunofluorescenza.Ciao, sono Sam Jang dei DSO National Laboratories e lavoro nel laboratorio del dottor Wee, nel programma sulle malattie infettive emergenti, dopo la specializzazione presso la NUS Graduate Medical School. Oggi vi mostrerò come marcare fluorescentemente il virus Denki con il colorante Alexa Fluor reattivo verso le ammine per studi di imaging. I coloranti Alexa Fluor presentano una stabilità superiore e sono meno sensibili al pH rispetto a coloranti comuni come la fluoresceina e la rodamina, rendendoli ideali per studi sull'assorbimento cellulare e sul trasporto endosomiale del virus.L'etichettatura del virus della dengue con Alexa Fluor faciliterà la comprensione della patogenesi della dengue. Cominciamo. Prima della reazione di etichettatura, preparare fresco il buffer per l'etichettatura e il reagente di arresto seguendo il protocollo scritto e purificare il virus della dengue mediante cuscino di saccarosio; aggiungere un volume appropriato del virus della dengue purificato al buffer di etichettatura in una provetta da microcentrifuga per raggiungere una concentrazione di 300 milioni di unità formanti per millilitro.Questa procedura può essere aumentata proporzionalmente per l'etichettatura in batch del virus. Ricostruire il colorante Alexa Fluor liofilizzato fino a una concentrazione di un millimolare nel buffer di etichettatura immediatamente prima della reazione di etichettatura.Minimizzare l'esposizione alla luce a partire da questo passaggio. A scopo dimostrativo, il colorante Alexa floor verrà lasciato non protetto dalla luce; aggiungere 800 microlitri della soluzione di colorante Alexa flow da un millimolare al virus della dengue diluito, mescolando delicatamente con la punta della micropipetta.Incubare per un'ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, mescolando con inversioni delicate ogni 15 minuti. Dopo un'ora, centrifugare brevemente i tubi. Trasferire 800 microlitri della fase superiore, prelevandola delicatamente con la micropipetta, e incubare per un'ulteriore ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, mescolando con inversioni delicate ogni 15 minuti.Nel frattempo, equilibrare la colonna di purificazione con 25 millilitri di tampone HNE. Dopo l'incubazione di un'ora, applicare il virus marcato sulla colonna e iniziare a raccogliere il flusso in uscita. Riempire la colonna con tampone HNE.Una volta che tutto il virus marcato è entrato nella matrice, scartare i primi 2,5 millilitri del flusso iniziale e raccogliere i successivi due millilitri della frazione di virus marcato. Conservare il virus marcato purificato a meno 80 gradi Celsius. Determinare il titolo del virus marcato mediante saggio delle placche.In un esperimento tipico, si dovrebbe osservare una riduzione inferiore a dieci volte nel titolo del virus. Dopo la marcatura, va eseguito un saggio di immunofluorescenza per valutare il grado di marcatura. A tal fine, enumerare le cellule virali utilizzando un emocitometro e aggiungere il volume appropriato di cellule al mezzo di crescita per ottenere una densità di 50.000 cellule per millilitro.Versare un millilitro di cellule virali per pozzetto in una piastra a quattro pozzetti contenente un coprivetro sterile. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Rimuovere la piastra dall'incubatore ed aspirare il sopranatante da ogni pozzetto; aggiungere effettivamente le cellule con un MOI di circa uno del virus marcato in un volume di cento microlitri per 10 minuti a 37 gradi Celsius.Rimuovere l'inoculo e lavare le cellule con 0,5 millilitri di tampone PBS per pozzetto. Aspirare e ripetere questa procedura altre due volte. Fissare le cellule con 200 microlitri di paraformaldeide al 3% per pozzetto a temperatura ambiente per 30 minuti.Lavare le cellule tre volte con 0,5 millilitri di tampone PBS per pozzetto. Fissare le cellule con soluzione di fissazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere il coprivetrino dal pozzetto utilizzando pinzette fini.Svuotare il liquido in eccesso battendo delicatamente il bordo del coprivetrino. Farlo scivolare su un foglio bianco. Posizionare il coprivetrino con il lato delle cellule verso il basso.Applicare 25 microlitri di anticorpo contro la proteina E del dengue su un pezzetto di parafilm. Incubare per un'ora in una camera umidificata a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Successivamente, trasferire il cover slip in una piastra a sei pozzetti e aggiungere due millilitri di buffer di lavaggio per ogni pozzetto.Aspirare il soprannatante. Ripetere questi passaggi di lavaggio altre due volte dopo l'ultimo lavaggio. Rimuovere il vetrino dalla pozzetta utilizzando pinzette fini.Svuotare il liquido in eccesso immergendo il bordo del coprioggetto. Farlo scivolare su un fazzoletto di carta. Posizionare il lato della cellula del coprioggetto.Incubare per 25 microlitri di Alexa floor con otto otto anticorpo secondario anti topo su un pezzo di vetrino. Incubare per 45 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Al termine dell'incubazione, trasferire il vetrino coprioggetto in una piastra a sei pozzetti e lavare le cellule tre volte con due millilitri di buffer di lavaggio per ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il vetrino dal pozzetto e risciacquare una volta con acqua ionizzata.Svuotare il liquido in eccesso immergendo su un foglio di carta. Applicare il coprioggetto su un vetrino al microscopio con otto microlitri di una soluzione di montaggio delicata. Lasciare solidificare la soluzione di montaggio durante la notte in aria a quattro gradi Celsius.Il campione è ora pronto per essere visualizzato con un microscopio a fluorescenza o confocale. Posizionare una piccola goccia di olio di immersione sulla superficie del vetrino coprioggetto e fissare il microscopio. Collocare sul portacampioni del microscopio.Regolare la piastra finché l'obiettivo del microscopio entra in contatto con l'olio di immersione. Per un'immagine più chiara, spegnere le luci ambientali utilizzando il software Zes Zen. Fare clic sulla presa oculare per l'osservazione diretta del campione attraverso l'oculare del microscopio.Trova un campo con cellule e regola il fuoco. Passa ora alla modalità di acquisizione. Per minimizzare il crosstalk tra i canali floreali, seleziona tracce separate per Alexa Fluor 488 e Finite Four.Utilizzare coloranti e impostare le acquisizioni per l'eccitazione e la rilevazione sequenziali. Regolare il guadagno e l'offset della potenza del laser per assicurarsi che l'immagine non sia sovraesposta o sottoesposta. Acquisire l'immagine e analizzare un'area di interesse mediante la funzione di codistribuzione.Il coefficiente di sovrapposizione può essere utilizzato per stimare il grado di marcatura del virus della dengue mediante il colorante Alexa Fluor. È stato eseguito un semplice saggio di immunofluorescenza su cellule virali e il grado di marcatura può essere stimato dalla colocalizzazione del virus marcato con la colorazione dell'anticorpo anti-proteina E. I valori del coefficiente di sovrapposizione variano tra 0,65 e 0,8, suggerendo che approssimativamente dal 65 al 80% delle particelle virali è stato marcato con il colorante Alexa Fluor. Affinché la procedura di marcatura abbia successo, è fondamentale preparare il buffer di marcatura fresco e ricostituire il colorante Alexa Fluor immediatamente prima della marcatura.La concentrazione del colorante da utilizzare può essere ulteriormente ottimizzata in base alle proprie esigenze. Questo metodo di marcatura del virus del dengue potrebbe potenzialmente essere adattato per marcare altri virus. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna per il tuo esperimento di marcatura.

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Questo video mostra il processo di valutazione della distribuzione intracellulare dei coniugati di anticorpi modificati con peptidi derivati da virus utilizzando la microscopia confocale. La sequenza di localizzazione nucleare di derivazione virale dirige i coniugati anticorpo-corpo all'interno del citoplasma, confermati attraverso l'immunocolorazione e la misurazione della fluorescenza.

Valutazione della distribuzione intracellulare dei coniugati di anticorpi modificati con peptidi derivati da virus

Questo metodo descrive l'uso di chimica di clic per misurare le variazioni di trascrizione della cellula ospite dopo l'infezione con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12. I risultati possono essere visualizzati qualitativamente tramite microscopia a fluorescenza o ottenuti quantitativamente mediante citometria a flusso. Questo metodo è adattabile per l'uso con altri virus.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

I virus o le vescicole extracellulari sono stati immunocatturati con nanoparticelle magnetiche da 15 nm accoppiate ad anticorpi che riconoscono gli antigeni di superficie. I virioni o le vescicole catturati sono stati marcati con anticorpi fluorescenti contro altri antigeni di superficie. I complessi risultanti sono stati separati in un campo magnetico elevato e analizzati con citometri a flusso convenzionali attivati a fluorescenza.

Flusso Virometry per analizzare antigenica spettri di virioni e extracellulare vescicole

I virus dell'influenza A (IAV) sono patogeni respiratori contagiosi che causano epidemie annuali e pandemie occasionali. Qui, descriviamo un protocollo per monitorare le infezioni virali in vivo utilizzando una nuova luciferasi ricombinante e la fluorescenza-espressione bireporter IAV (BIRFLU). Questo approccio fornisce ai ricercatori un eccellente strumento per studiare IAV in vivo.

Un virus fluorescente di Luciferasi-fluorescente Reporter per l'imaging dal vivo e la quantificazione dell'infezione virale

Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.

Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale

Impara a etichettare il virus Dengue con Alexa Fluor per la microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente di visualizzare le interazioni precoci tra virus e cellule ospiti, facilitando lo studio della patogenesi virale.

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

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