Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura
9 luglio 2011
Approfittando dei progressi nello sviluppo fluoroforo e tecnologia di imaging, un metodo semplice di Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue è stato ideato per visualizzare le prime interazioni tra virus e cellule.
L'obiettivo generale di questo esperimento è etichettare fluorescentemente il virus del dengue per studi microscopici. Preparare i tamponi necessari e purificare il virus del dengue con un cuscino di saccarosio; ricostituire il colorante Amy React Alexa Flow e il virus del dengue nel tampone di etichettatura. Etichettare il virus del dengue con cento micromoli di Alexa Flow.
Incubare per un'ora e arrestare la reazione di marcatura con il reagente secondario. Purificare il virus della dengue marcato mediante una colonna a esclusione dimensionale. Rieffettuare la titolazione del virus marcato mediante saggio di placche e stimare il grado di marcatura mediante saggio di immunofluorescenza.
Ciao, sono Sam Jang dei DSO National Laboratories e lavoro nel laboratorio del dottor Wee, nel programma sulle malattie infettive emergenti, dopo la scuola di medicina dell'NUS. Oggi vi mostrerò come etichettare fluorescentemente il virus Denki con il colorante Alexa Fluor reattivo all'ammina per studi di imaging. I coloranti Alexa Fluor presentano una stabilità superiore e sono meno sensibili al pH rispetto a coloranti comuni come la fluoresceina e la rodamina, rendendoli ideali per studi sull'assorbimento cellulare e sul trasporto endosomiale del virus.
L'etichettatura del virus della dengue con Alexa Fluor faciliterà la comprensione della patogenesi della dengue. Cominciamo. Prima della reazione di etichettatura, preparare fresco il tampone di etichettatura e il reagente di arresto seguendo il protocollo scritto e purificare il virus della dengue mediante cuscino di saccarosio; aggiungere un volume appropriato del virus della dengue purificato al tampone di etichettatura in una provetta da microcentrifuga per ottenere una concentrazione di 300 milioni di unità formanti per millilitro.
Questa procedura può essere aumentata proporzionalmente per l'etichettatura in batch del virus. Ricostruire il colorante Alexa Fluor liofilizzato fino a una concentrazione di un millimolare nel buffer di etichettatura immediatamente prima della reazione di etichettatura.
Minimizzare l'esposizione alla luce a partire da questo passaggio. A scopo dimostrativo, il colorante Alexa floor verrà lasciato non protetto dalla luce; aggiungere 800 microlitri della soluzione di colorante Alexa flow da un millimolare al virus della dengue diluito, mescolando delicatamente con la punta della micropipetta.
Incubare per un'ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, mescolando con inversioni delicate ogni 15 minuti. Dopo un'ora, centrifugare brevemente i tubi. Trasferire 800 microlitri della fase inferiore, prelevandoli delicatamente con una micropipetta, e incubare per un'ulteriore ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, mescolando con inversioni delicate ogni 15 minuti.
Nel frattempo, equilibrare la colonna di purificazione con 25 millilitri di tampone HNE. Dopo l'incubazione di un'ora, applicare il virus marcato sulla colonna e iniziare a raccogliere il flusso in uscita. Riempire la colonna con tampone HNE.
Una volta che tutto il virus marcato è entrato nella matrice, scartare i primi 2,5 millilitri del flusso iniziale e raccogliere i successivi due millilitri della frazione di virus marcato. Conservare il virus marcato purificato a meno 80 gradi Celsius. Determinare il titolo del virus marcato mediante saggio delle placche.
In un esperimento tipico, si dovrebbe osservare una riduzione inferiore a dieci volte nel titolo del virus. Dopo la marcatura, va eseguito un saggio di immunofluorescenza per valutare il grado di marcatura. A tale scopo, enumerare le cellule virali utilizzando un emocitometro e aggiungere il volume appropriato di cellule al mezzo di crescita per ottenere una densità di 50.000 cellule per millilitro.
Versare un millilitro di cellule virali per pozzetto in una piastra a quattro pozzetti contenente un coprivetro sterile. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Rimuovere la piastra dall'incubatore ed aspirare il sopranatante da ogni pozzetto; aggiungere effettivamente le cellule con un MOI di circa uno del virus marcato in un volume di cento microlitri per 10 minuti a 37 gradi Celsius.
Rimuovere l'inoculo e lavare le cellule con 0,5 millilitri di tampone PBS per pozzetto. Aspirare e ripetere questa procedura altre due volte. Fissare le cellule con 200 microlitri di paraformaldeide al 3% per pozzetto a temperatura ambiente per 30 minuti.
Lavare le cellule tre volte con 0,5 millilitri di tampone PBS per pozzetto. Fissare le cellule con la soluzione di fissazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere il coprivetrino dal pozzetto utilizzando pinzette fini.
Svuotare il liquido in eccesso battendo delicatamente il bordo del coprivetrino. Farlo scivolare su un foglio bianco. Posizionare il coprivetrino con il lato delle cellule verso il basso.
Incubare 25 microlitri di anticorpo contro la proteina E del dengue su un pezzetto di parafilm. Incubare per un'ora in una camera umidificata a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Successivamente, trasferire il cover slip in una piastra a sei pozzetti e aggiungere due millilitri di buffer di lavaggio per ogni pozzetto.
Aspirare il soprannatante. Ripetere questi passaggi di lavaggio altre due volte dopo l'ultimo lavaggio. Rimuovere il vetrino dalla pozzetta utilizzando pinzette fini.
Svuotare il liquido in eccesso immergendo il bordo del coprioggetto. Farlo scivolare su un fazzoletto di carta. Posizionare il coprioggetto con il lato delle cellule verso il basso.
Incubare 25 microlitri di Alexa con un anticorpo secondario anti-topo su un pezzetto di vetrino. Incubare per 45 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Al termine dell'incubazione, trasferire il vetrino in una piastra a sei pozzetti e lavare le cellule tre volte con due millilitri di buffer di lavaggio per ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il vetrino dal pozzetto e risciacquarlo una volta con acqua ionizzata.
Svuotare il liquido in eccesso immergendo su un foglio di carta. Applicare il coprioggetto su un vetrino al microscopio con otto microlitri di una soluzione di montaggio delicata. Lasciare solidificare la soluzione di montaggio durante la notte in aria a quattro gradi Celsius.
Il campione è ora pronto per essere visualizzato con un microscopio a fluorescenza o confocale. Applicare una piccola goccia di olio di immersione sulla superficie del vetrino coprioggetto e fissare il microscopio. Posizionare sul portapreparati del microscopio.
Regolare la piastra finché l'obiettivo del microscopio non entra in contatto con l'olio di immersione. Per un'immagine più chiara, spegnere le luci ambientali utilizzando il software Zes Zen. Fare clic sul tasto dell'oculare per l'osservazione diretta del campione attraverso l'oculare del microscopio.
Trova un campo con cellule e regola il fuoco. Passa ora alla modalità di acquisizione. Per minimizzare il crosstalk tra i canali floreali, seleziona tracce separate per Alexa Fluor 488 e Finite Four.
Utilizzare coloranti e impostare le acquisizioni per l'eccitazione e la rilevazione sequenziali. Regolare il guadagno e l'offset della potenza del laser per assicurarsi che l'immagine non sia sovraesposta o sottoesposta. Acquisire l'immagine e analizzare un'area di interesse mediante la funzione di colocalizzazione.
Il coefficiente di sovrapposizione può essere utilizzato per stimare il grado di marcatura del virus della dengue mediante il colorante Alexa Fluor. È stato eseguito un semplice saggio di immunofluorescenza su cellule virali e il grado di marcatura può essere stimato dalla colocalizzazione del virus marcato con la colorazione dell'anticorpo anti-proteina E. I valori del coefficiente di sovrapposizione variano tra 0,65 e 0,8, suggerendo che approssimativamente dal 65 al 80% delle particelle virali è stato marcato con il colorante Alexa Fluor. Affinché la procedura di marcatura abbia successo, è fondamentale preparare il buffer di marcatura fresco e ricostituire il colorante Alexa Fluor immediatamente prima della marcatura.
La concentrazione del colorante da utilizzare può essere ulteriormente ottimizzata in base alle proprie esigenze. Questo metodo di marcatura del virus della dengue potrebbe potenzialmente essere adattato per marcare altri virus. Ecco tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna per il tuo esperimento di marcatura.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per l'etichettatura fluorescente del virus della dengue mediante Alexa Fluor per l'analisi microscopica. L'approccio consente la visualizzazione delle interazioni iniziali tra il virus e le cellule ospiti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia
- Microscopia a fluorescenza
- Biologia cellulare
Sfondo
- Il virus del dengue rappresenta un problema significativo per la salute globale.
- Comprendere le interazioni tra virus e cellule è fondamentale per lo sviluppo di strategie antivirali.
- La marcatura fluorescente migliora la visualizzazione di queste interazioni.
- I progressi nelle tecnologie di imaging facilitano studi dettagliati.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'etichettatura del virus del dengue.
- Visualizzare le interazioni tra il virus del dengue e le cellule ospiti.
- Migliorare la comprensione delle fasi iniziali dell'infezione virale.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dei tamponi necessari per la marcatura.
- Purificazione del virus della dengue mediante cuscinetto di saccarosio.
- Ricostituzione del colorante Alexa Fluor nel tampone di marcatura.
- Marcatura del virus con una concentrazione specifica di colorante.
Risultati principali
- Etichettatura fluorescente riuscita del virus del dengue.
- Visualizzazione delle interazioni virus-cellula al microscopio.
- Valutazione dell'efficienza di etichettatura mediante saggio di immunofluorescenza.
- Rititolazione del virus etichettato mediante saggio delle placche.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un modo semplice ed efficace per marcare il virus della dengue.
- Il marcamento fluorescente facilita lo studio delle interazioni tra virus e ospite.
- Questa tecnica può essere applicata ad altri studi virali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
L'etichettatura fluorescente diretta del virus del dengue con Alexa Fluor consente una visualizzazione precisa delle interazioni tra virus e cellule, supportando studi meccanicistici in fase iniziale nella ricerca sulle malattie infettive. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e orienta le strategie traslazionali per lo sviluppo di antivirali e vaccini. La compatibilità del metodo con virus vivi e con l'imaging quantitativo rafforza il suo valore in tutte le fasi di scoperta e precliniche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi diretta dei meccanismi di ingresso e traffico virale nelle cellule ospiti.
- Supporta la riduzione dei rischi biologici chiarificando gli eventi iniziali dell'infezione rilevanti per la patogenesi.
- Facilita la validazione funzionale delle target mediante la visualizzazione delle interazioni del virus marcato.
- Migliora l'affidabilità predittiva nei test ipotetici terapeutici successivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un approccio standardizzato per la preparazione di virus marcati con fluorocromi per saggi basati sull'immagine.
- Garantisce riproducibilità e valutazione quantitativa dell'efficienza di marcatura mediante immunofluorescenza e saggi di placca.
- Permette una marcatura scalabile in lotti, adatta a piattaforme di screening ad alto contenuto.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti dei composti antivirali sull'ingresso del virus nelle cellule e sul traffico intracellulare.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la malattia preservando l'infettività virale dopo la marcatura.
- Permette una continuità dalla scoperta meccanicistica alla validazione preclinica di strategie terapeutiche.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio fornendo letture quantitative tramite imaging.
- Facilita l'allineamento di biomarcatori attraverso l'analisi di colocalizzazione di marcatori virali e cellulari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di marcatura si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, sostenendo studi basati su ipotesi, lo sviluppo di saggi e la ricerca traslazionale sulla patogenesi virale.
- Biologia della scoperta: Approfondisce la comprensione meccanicistica delle interazioni virus-ospite attraverso la visualizzazione diretta e la colocalizzazione quantitativa.
- Screening: Fornisce preparazioni di virus marcati riproducibili per lo screening basato su imaging di candidati antivirali.
- Analisi: Fornisce output quantitativi come coefficienti di sovrapposizione e titoli di infettività per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Mantiene il virus funzionale per l'uso in modelli cellulari rilevanti per le malattie e in studi sui biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo ampiamente adattabile per la marcatura di altri virus envelopati in diversi programmi di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca virologica in fase iniziale.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di etichettatura e di imaging virale per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e ottimizza l'allocazione delle risorse consentendo una valida validazione degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta in base al rischio dei candidati antivirali e vaccinali sulla base di dati quantitativi di imaging.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in virologia, microscopia a fluorescenza e analisi quantitativa delle immagini.
- Necessita dell'accesso a piattaforme di imaging di alta qualità e a software analitici per studi di codistribuzione.
- Richiede una preparazione rigorosa dei tamponi e un'accurata manipolazione dei coloranti per garantire riproducibilità e ridurre al minimo la citotossicità.
- Adattabile ad altri virus a involucro, previa ottimizzazione del protocollo per specifici sistemi virali.
- Dipende dal mantenimento della vitalità del virus e dell'efficienza di marcatura per le applicazioni successive.
