Metilazione del DNA: Modifica bisolfito e analisi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire l'analisi della metilazione del DNA dei dinucleotidi CPG mediante sequenziamento genomico del DNA convertito con solfito. Ciò si ottiene denaturando prima il DNA a doppio filamento, in modo che possa avvenire la reazione di conversione del bisolfito. Il secondo passo consiste nel convertire tutte le citosine non metilate nel DNA genomico in uracile mediante deaminazione del bisolfito.

Questa reazione prevede tre fasi. Il primo è la solfatazione del residuo di citosina mediante l'aggiunta di solfito B al doppio legame cinque sei. In secondo luogo, la deaminazione idraulica della citosina da parte del derivato del solfito produce un SSL da parte del derivato del solfito e, in terzo luogo, la rimozione del gruppo solfonato mediante trattamento alcalino produce un residuo di SSL.

Successivamente, la regione target viene amplificata da primer specifici per la conversione del bisolfito e dall'amplificazione PCR. La fase finale è il clonaggio e il sequenziamento del prodotto PCR per fornire una risoluzione a singolo nucleotide per la metilazione attraverso la molecola di DNA. In definitiva, i risultati mostrano la metilazione del DNA dei dinucleotidi CPG nel DNA genomico sfruttando l'aumentata sensibilità della citochina rispetto alla cinque citosina metilica alla deaminazione del bisolfato in condizioni acide.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'analisi del sangue meridionale, è che può consentire la risoluzione di un singolo nucleotide della metilazione d. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica, come il ruolo della metilazione del DNA nelle malattie umane come il cancro. Per preparare i campioni di DNA per la conversione del bisolfito, incubare prima due microgrammi di DNA genomico con bisolfito, tampone di lisi del DNA e un volume totale di 18 microlitri per un'ora a 37 gradi Celsius.

Quindi denaturare il DNA genomico aggiungendo due microlitri di idrossido di sodio a tre molari appena preparato a una concentrazione finale di 0,3 molari. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti a bagnomaria, seguiti da incubazione a 90 gradi Celsius per due minuti. In un blocco termico, posizionare immediatamente le provette sul ghiaccio per cinque minuti, centrifugare le provette per 10 secondi a 10.000 G per assicurarsi che il DNA sia sul fondo della provetta, i campioni di DNA denaturati sono ora pronti per la deaminazione delle cellule B, che verrà dimostrata in seguito.

Prima delle reazioni di solfatazione e deaminazione idrolitica, preparare soluzioni fresche di chinolo 10 millimolare e meta sodio saturo mediante solfito pH 5,0. Poiché il meta sodio del solfito è una soluzione satura, piccoli grumi possono rimanere non disciolti. Aggiungere il meta sodio per solfito 208 microlitri e il chinolo 12 microlitri al DNA denaturato 20 microlitri in un volume finale di 240 microlitri.

Agitare le provette e centrifugare per 10 secondi per assicurarsi che tutte le goccioline siano sul fondo della provetta. Sovrapporre i campioni con olio minerale. Incubare i campioni a 55 gradi Celsius in un bagno d'acqua per quattro-16 ore, a seconda della quantità e della qualità del DNA da convertire.

È importante che la conversione del bisolfito avvenga al buio per evitare l'ossidazione. Al termine del tempo di incubazione appropriato, centrifugare brevemente le provette in una microcentrifuga per assicurarsi che tutto il liquido sia sul fondo della provetta. Quindi pipettare con cura la soluzione di DNA dal fondo della provetta senza assorbire l'olio minerale.

Per i passaggi successivi, il nostro laboratorio utilizza il sistema di pulizia del DNA promega wizard. Aggiungere un millilitro di resina ai campioni di DNA, capovolgere la provetta per mescolare, quindi pipettare la soluzione in una siringa collegata a una colonna di desalinizzazione. Infine, per rimuovere eventuali ioni bi solfito liberi, passare il DNA trattato con bi solfito attraverso la colonna di desalinizzazione e alludere in 50 microlitri di acqua Milli Q.

Il passo successivo consiste nel rimuovere l'attico del bisolfito dall'anello dell'uracile mediante desalinizzazione. Per fare ciò, aggiungere 5,5 microlitri di idrossido di sodio a tre molari appena preparato a ciascun campione di DNA trattato con bisolfito per una concentrazione finale di 0,3 molari. Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Centrifugare brevemente i campioni e quindi aggiungere un microlitro di TRNA a ciascun campione. Neutralizzare la soluzione aggiungendo acetato di ammonio a una concentrazione finale di tre molari. Successivamente, l'etanolo precipita il DNA.

Aggiungere ghiaccio freddo, etanolo al 100% 330 microlitri e mescolare bene per inversione. Lasciare a meno 20 gradi Celsius per un'ora per centrifugare durante la notte a 14.000 GS per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere tutte le tracce di surnatante e asciugare all'aria il DNA precipitato per circa 20 minuti.

Dopo l'essiccazione all'aria, il pellet è quasi impossibile vedere risospendere il pellet di DNA in 50 microlitri di 0,1 XTE o lasciare in acqua a temperatura ambiente per circa due ore durante questo periodo, di tanto in tanto, vorticare le provette per garantire che il DNA sia sciolto, seguito da una centrifuga veloce. Una volta disciolto, il DNA può essere conservato a meno 20 gradi Celsius per un periodo compreso tra uno e 10 anni, a seconda della quantità e della qualità del DNA, oppure può essere utilizzato immediatamente. Per l'amplificazione della PCR, l'ottimizzazione del primer è l'aspetto più difficile di questa procedura.

Pertanto, vengono fornite le seguenti linee guida per garantire il successo della progettazione dei primer. Per illustrare queste linee guida, la sequenza target è stata convertita mediante solfito in modo che, quando scritte, le citosine convertite appaiano come T blu e i siti CPG non convertiti appaiano come primer cgs rossi, dovrebbero essere lunghi da 24 a 30 paia di basi per garantire la specificità. Gli inneschi dovrebbero avere una TM prevista in modo simile superiore a 50 gradi Celsius e non differire di più di uno o due gradi Celsius.

I primer devono contenere più basi da C a T circa il 25% per garantire la specificità della conversione. La base finale secondo cui le tre estremità prime dovrebbero essere da C a T per garantire l'amplificazione dei dinucleotidi D-N-A-C-P-G convertiti dovrebbe essere evitata nella sequenza del primer per evitare potenziali distorsioni verso modelli metilati non metilati o non convertiti. Tuttavia, se inevitabile, la citosina nel sito CPG dovrebbe essere sostituita con una Y per garantire un'amplificazione imparziale del DNA convertito.

Infine, progettare set di primer nidificati o semi-nidificati per garantire la specificità o la sensibilità della reazione PCR, se necessario. Preparare miscele di reazioni di amplificazione PCR in aliquote da 25 microlitri per l'ottimizzazione. Ogni reazione contiene mediante solfito convertito DNA genomico DPS primer, cloruro di magnesio, cloruro di potassio tris cloridrato pH 8,3 anac polimerasi per testare il bias di amplificazione di materiale metilato o non metilato.

Utilizzare un campione di controllo convertito in 50 50 metilato non metilato completamente bi solfito per testare l'amplificazione proporzionale della PCR con conversione del bi solfito. I primer specifici e la miscela di reazione PCR in un termociclatore a gradiente di temperatura impostano la reazione di corsa in un gradiente di più o meno tre gradi Celsius dal TM del primer attraverso da otto a 10 provette, fanno vorticare le provette e girano brevemente in una microcentrifuga prima di inserirle nel termociclatore. Questa figura mostra un gel agros con un profilo di amplificazione PCR a gradiente di temperatura da una miscela di DNA metilato e non metilato al 50%.

Gli ampliconi e le corsie PCR contrassegnate con le corsie T due, cinque e otto sono stati trattati con un enzima di restrizione che digerisce solo il DNA metilato Le condizioni ottimali di amplificazione PCR dovrebbero amplificare gli ampliconi metilati e non metilati in proporzione e senza distorsioni, risultando in una quantità uguale di prodotto PCR tagliato e non tagliato come mostrato qui. Le condizioni ottimali di termociclo per l'amplificazione non polarizzata sono a 55,6 gradi Celsius. La conversione completa del DNA del bisolfito può essere analizzata mediante digestione con un enzima sito-specifico della citosina che digerisce solo le corsie tre, sei e nove del DNA non convertito.

La conversione completa del DNA bisolfito è indicata qui dall'assenza di DNA tagliato in tutte e tre le corsie, corsie tre, sei e nove. Questo grafico di dissociazione in tempo reale mostra una proporzione uguale di miscela 50 50 della linea arancione rossa del DNA metilato e non metilato rispetto all'amplificazione di controllo della linea rosa m completamente metilata e della linea verde U del DNA non metilato, che si dissociano rispettivamente a 82,9 gradi Celsius e 86,9 gradi Celsius. Ciò indica che non esiste una distorsione di amplificazione basata sulla temperatura alla quale le diverse molecole si dissociano.

I frammenti di PCR risultanti dall'amplificazione di campioni trattati con bisolfito possono essere visualizzati mediante elettroforesi su gel agros e sequenziati. Qui è mostrata una traccia di sequenza da tre diverse linee cellulari con i siti CPG evidenziati in giallo. La linea cellulare X mostra il 100% di metilazione in tutti e tre i siti CPG, mentre le linee cellulari Y e Z mostrano vari gradi di metilazione, come si vede dai segnali GA sovrapposti mostrati qui. La figura quattro A è una traccia di sequenza da tre diverse linee cellulari con i siti CPG evidenziati in giallo.

Dopo il sequenziamento diretto dei singoli cloni, lo stato di metilazione delle singole molecole può essere tabulato in una mappa di bisolfito. Per visualizzare l'eterogeneità della metilazione, la densità della metilazione nei singoli siti CPG è mostrata in rosso. In questa mappa rappresentativa del bisolfito, analisi quantitativa della metilazione ad alto rendimento di un campione.

L'uso della tecnologia dell'epitipizzazione del sequenzianome può produrre uno spettro specifico dipendente dalla presenza di citosine metilate, come mostrato in questo esempio Figura cinque A.Un riepilogo dei rapporti nel campione può quindi essere estrapolato sotto forma di un epigramma figura cinque B.Questo esempio mostra la percentuale di metilazione del DNA in ciascun sito CPG per quattro diverse linee cellulari. Infine, un grafico di metilazione riassuntivo figura cinque C può essere derivato dall'epigramma Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare la metilazione del DNA e il suo ruolo nelle malattie umane.