Metilazione del DNA: Modifica bisolfito e analisi

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire l'analisi della metilazione del DNA nei dinucleotidi CPG mediante sequenziamento genomico del DNA convertito con solfito. Questo viene ottenuto innanzitutto denaturando il DNA a doppio filamento, in modo che possa avvenire la reazione di conversione con bisolfito. Il secondo passaggio consiste nella conversione di tutte le citosine non metilate nel DNA genomico in uracile mediante deaminazione con bisolfito.

Questa reazione comprende tre fasi. La prima è la solfatazione del residuo di citosina mediante l'aggiunta di bisolfito al doppio legame tra i carboni cinque e sei. In secondo luogo, la deaminazione idrolitica della citosina da parte di un derivato del bisolfito produce un residuo di SSL; infine, la rimozione del gruppo solfonato mediante trattamento alcalino dà origine a un residuo di SSL.

Successivamente, la regione bersaglio viene amplificata mediante primer specifici per la conversione con bisolfito e amplificazione PCR. L'ultimo passaggio consiste nel clonaggio e nel sequenziamento del prodotto PCR per ottenere una risoluzione a singolo nucleotide della metilazione lungo la molecola di DNA. In definitiva, i risultati mostrano la metilazione del DNA dei dinucleotidi CPG nel DNA genomico sfruttando la maggiore sensibilità della citosina rispetto alla cinque metil citosine alla deaminazione con bisolfito in condizioni acide.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'analisi del sangue di Southern è che consente una risoluzione a livello di singolo nucleotide della metilazione del DNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epigenetica, come il ruolo della metilazione del DNA in malattie umane come il cancro. Per preparare i campioni di DNA per la conversione con bisolfito, incubare innanzitutto due microgrammi di DNA genomico con bisolfito, buffer di lisi del DNA e un volume totale di 18 microlitri per un'ora a 37 gradi Celsius.

Denaturare quindi il DNA genomico aggiungendo due microlitri di idrossido di sodio 3 molare appena preparato per ottenere una concentrazione finale di 0,3 molare. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti in un bagno termico, seguito da un'incubazione a 90 gradi Celsius per due minuti. In un blocco termoregolato, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio per cinque minuti, quindi centrifugare i tubi per 10 secondi a 10.000 ×g per assicurarsi che il DNA si trovi sul fondo del tubo; i campioni di DNA denaturato sono ora pronti per la deaminazione B cell fight, che verrà dimostrata successivamente.

Prima delle reazioni di solfatazione e deaminazione idrolitica, preparare soluzioni fresche di quinolo 10 millimolare e metabisolfito di sodio satura a pH 5,0. Poiché il metabisolfito di sodio è una soluzione satura, piccoli grumi potrebbero rimanere non disciolti. Aggiungere 208 microlitri di metabisolfito di sodio e 12 microlitri di quinolo al DNA denaturato di 20 microlitri, portando a un volume finale di 240 microlitri.

Vortexare i tubi e centrifugare per 10 secondi per assicurarsi che tutte le goccioline siano in fondo al tubo. Sovrapporre ai campioni olio minerale. Incubare i campioni a 55 gradi Celsius in un bagno termico per quattro-ciciassette ore, a seconda della quantità e qualità del DNA da convertire.

È importante che la conversione con bisolfito avvenga al buio per evitare l'ossidazione. Al termine del tempo di incubazione appropriato, centrifugare brevemente i tubi in una microcentrifuga per assicurarsi che tutto il liquido si trovi in fondo al tubo. Quindi, prelevare con attenzione la soluzione di DNA dal fondo del tubo senza aspirare l'olio minerale.

Per i passaggi successivi, il nostro laboratorio utilizza il sistema Promega Wizard di purificazione del DNA. Aggiungere un millilitro di resina ai campioni di DNA, capovolgere il tubo per mescolare, quindi trasferire la soluzione con una pipetta in una siringa collegata a una colonna di desalazione. Infine, per rimuovere eventuali ioni bisolfito liberi, far passare il DNA trattato con bisolfito attraverso la colonna di desalazione ed eluire in 50 microlitri di acqua Milli-Q.

Il passo successivo consiste nel rimuovere il gruppo bisolfito dall'anello di uracile mediante desolfitazione. Per ottenere questo, aggiungere 5,5 µL di idrossido di sodio 3 M appena preparato a ciascun campione di DNA trattato con bisolfito, per una concentrazione finale di 0,3 M. Successivamente, incubare i campioni a 37 °C per 15 minuti.

Centrifugare brevemente i campioni e quindi aggiungere un microlitro di TRNA a ciascun campione. Neutralizzare la soluzione aggiungendo acetato di ammonio fino a una concentrazione finale di tre molarità. Successivamente, precipitare il DNA con etanolo.

Aggiungere 330 microlitri di etanolo al 100% freddo di ghiaccio e mescolare bene per inversione. Lasciare a meno 20 gradi Celsius per un'ora fino a tutta la notte, quindi centrifugare a 14.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere quindi ogni traccia di supernatante ed essiccare all'aria il DNA precipitato per circa 20 minuti.

Dopo l'essiccazione all'aria, il pellet è quasi impossibile da vedere; risospendere il pellet di DNA in 50 microlitri di 0,1 XTE o acqua e lasciare a temperatura ambiente per circa due ore. Durante questo periodo, vorticare occasionalmente i tubi per assicurare che il DNA sia completamente disciolto, seguito da una breve centrifugazione. Una volta che il DNA è disciolto, può essere conservato a meno 20 gradi Celsius da uno a 10 anni, a seconda della quantità e della qualità del DNA, oppure può essere utilizzato immediatamente. Per l'amplificazione mediante PCR, l'ottimizzazione dei primer rappresenta l'aspetto più difficile di questa procedura.

Pertanto, vengono fornite le seguenti linee guida per aiutare a garantire il successo nella progettazione dei primer. Per illustrare queste linee guida, la sequenza bersaglio è stata convertita mediante solfito, in modo che, quando scritta, le citosine convertite appaiano come Ts blu e i siti CPG non convertiti appaiano come cgs rossi. I primer dovrebbero avere una lunghezza compresa tra 24 e 30 paia di basi per garantire specificità. I primer dovrebbero presentare una temperatura di melting (TM) prevista simile, superiore a 50 gradi Celsius, e non differire di più di uno o due gradi Celsius.

I primer dovrebbero contenere diverse basi C a T approssimativamente al 25% per garantire la specificità della conversione. L'ultima base all'estremità tre prime dovrebbe essere una C a T per assicurare l'amplificazione dei dinucleotidi D-N-A-C-P-G convertiti; i dinucleotidi C-P-G devono essere evitati nella sequenza del primer per prevenire un potenziale bias verso templati metilati, non metilati o non convertiti. Tuttavia, se inevitabile, la citosina nel sito C-P-G deve essere sostituita con una Y per contribuire a garantire un'amplificazione non distorta del D-N-A convertito.

Infine, progettare set di primer nested o semi-nested per garantire specificità o sensibilità della reazione PCR, se necessario. Preparare miscele di reazione per l'amplificazione PCR in aliquote da 25 microlitri per l'ottimizzazione. Ogni reazione contiene DNA genomico convertito con bisolfito, primer DPS, cloruro di magnesio, cloruro di potassio, tris cloridrato pH 8,3 e anac polimerasi per verificare l'eventuale bias di amplificazione del materiale metilato o non metilato.

Utilizzare un campione di controllo metilato non metilato al 50 50 completamente convertito con bisolfito per verificare l'amplificazione PCR proporzionale con la conversione a bisolfito. Utilizzare primer specifici e una miscela di reazione PCR in un termociclatore a gradiente termico impostando la reazione in un gradiente di più o meno tre gradi Celsius rispetto alla TM del primer su otto a dieci provette, vortexare le provette e centrifugarle brevemente in un microcentrifugo prima di posizionarle nel termociclatore. Questa figura mostra un gel di agarosio con un profilo di amplificazione PCR a gradiente termico ottenuto da una miscela di DNA metilato e non metilato al 50%.

Gli ampliconi PCR e le corsie contrassegnate con T, ovvero le corsie due, cinque e otto, sono stati trattati con un enzima di restrizione che digerisce solo il DNA metilato; condizioni ottimali di amplificazione PCR dovrebbero amplificare gli ampliconi metilati e non metilati in proporzione e senza bias, producendo una quantità uguale di prodotto PCR tagliato e non tagliato, come mostrato qui. Le condizioni ottimali di termociclaggio per un'amplificazione non distorta sono a 55,6 gradi Celsius. La completa conversione del DNA con bisolfito può essere analizzata mediante digestione con un enzima specifico per il sito di citosina, che digerisce solo il DNA non convertito, ovvero le corsie tre, sei e nove.

La completa conversione del DNA con bisolfito è indicata qui dall'assenza di DNA tagliato in tutte e tre le corsie, le corsie tre, sei e nove. Questo grafico di dissociazione in tempo reale mostra una proporzione uguale di DNA metilato e non metilato, linea arancione-rossa, miscela 50 50, rispetto all'amplificazione di controllo di DNA completamente metilato, linea rosa m, e non metilato, linea verde U, che si dissociano rispettivamente a 82,9 gradi Celsius e 86,9 gradi Celsius. Ciò indica che non vi è alcun bias di amplificazione in base alla temperatura alla quale le diverse molecole si dissociano.

I frammenti di PCR risultanti dall'amplificazione di campioni trattati con bisolfito possono essere visualizzati mediante elettroforesi su gel agarosio e sequenziati. Qui mostrato direttamente è un tracciato di sequenza di tre linee cellulari diverse, con i siti CPG evidenziati in giallo: la linea cellulare X mostra una metilazione al 100% in tutti e tre i siti CPG, mentre le linee cellulari Y e Z mostrano gradi variabili di metilazione, come evidenziato dai segnali GA sovrapposti mostrati qui. La figura quattro A è un tracciato di sequenza di tre linee cellulari diverse, con i siti CPG evidenziati in giallo.

Dopo il sequenziamento diretto di singoli cloni, lo stato di metilazione delle singole molecole può essere riportato in una mappa di bisolfito. Per visualizzare l'eterogeneità della metilazione, la densità di metilazione nei singoli siti CPG è mostrata in rosso. In questa mappa di bisolfito rappresentativa, analisi quantitative ad alto rendimento della metilazione di un campione.

L'utilizzo della tecnologia Sequenom Epi Typer può produrre uno spettro specifico in base alla presenza di citosine metilate, come mostrato nell'esempio della Figura cinque A. Un riassunto dei rapporti nel campione può quindi essere estrapolato sotto forma di un epigramma, Figura cinque B. Questo esempio mostra la percentuale di metilazione del DNA in ciascun sito CpG per quattro linee cellulari diverse. Infine, un grafico riassuntivo della metilazione, Figura cinque C, può essere ottenuto a partire dall'epigramma dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare la metilazione del DNA e il suo ruolo nelle malattie umane.