JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:58 min. • June 17th, 2025
Fissare un topo transgenico anestetizzato in una cornice stereotassica con il cranio esposto.
Questo topo esprime la Cre ricombinasi nelle cellule gliali.
Posizionare il braccio stereotassico che tiene il tubo capillare sopra il cranio e allinearlo sopra il bregma.
Regola gli assi stereotassici per un puntamento preciso.
Praticare un foro nel sito di destinazione, assicurandosi che la dura madre rimanga intatta. Rimuovere i frammenti ossei.
Lavare il tubo capillare con il tampone. Disegna una bolla d'aria, quindi carica il virus adeno-associato che trasporta la riprogrammazione neuronale inattiva e i geni delle proteine fluorescenti.
Abbassare il tubo capillare alla profondità target e iniettare la soluzione virale nella regione ricca di cellule gliali.
Ritrarre con cautela il tubo per evitare il riflusso.
Chiudere l'incisione e consentire il recupero.
I virus internalizzati forniscono geni inattivati fiancheggiati da loxP al nucleo gliale. La cre ricombinasi li capovolge, attivando i geni di riprogrammazione neuronale e guidando la conversione neuronale. Gli interneuroni riprogrammati esprimono la proteina fluorescente sotto il promotore neurone-specifico.
Per iniettare i fattori di riprogrammazione, posizionare un topo anestetizzato nel telaio stereotassico, somministrare un'analgesia appropriata all'inizio dell'intervento, quindi portare la punta del capillare di vetro dell'ago per iniezione appena sopra il bregma. Assicurarsi che la punta del capillare sia perfettamente diritta su entrambi i piani A-P e M-L. Reimpostare entrambi i valori M-L e A-P su 0.0 sul contatore di coordinate digitale.
Per assicurarsi che la testa dell'animale sia in una posizione perfettamente piana, utilizzare il contatore di coordinate digitale per misurare il valore della coordinata D-V quando il braccio A-P è a più 2,0 e meno 2,0, nonché quando il braccio M-L è a più 2,0 e meno 2,0. Regolare di conseguenza l'altezza della barra dentale e delle barre auricolari. Successivamente, sollevare leggermente la siringa e praticare un foro utilizzando un trapano dentale alle coordinate di iniezione.
Inizia a perforare in loco, lavorando in modo circolare e delicato. Quindi, posizionare un pezzo di garza di cotone sull'incisione aperta e sciacquare la siringa con una soluzione salina. Dopo il lavaggio, aspirare una bolla d'aria e poi 1 microlitro di soluzione contenente il vettore virale. Assicurati che la soluzione virale possa essere facilmente visualizzata sotto la bolla d'aria.
Quindi, abbassare la siringa, progredendo lentamente fino alla profondità desiderata e assicurarsi che la traiettoria sia priva di frammenti ossei. Successivamente, iniettare 1 microlitro di soluzione virale a una velocità di 0,4 microlitri al minuto. Al termine dell'iniezione, attendere due minuti per la diffusione prima di estrarre la siringa.
Dopo la diffusione, ritrarre lentamente la siringa fino a quando la punta del capillare non è completamente ritirata dal cervello. Quindi, sutura con cura l'incisione e rimuovi l'animale dal telaio stereotassico. Monitorare l'animale in una stazione postoperatoria fino a quando non viene ripreso conoscenza.
Gli animali vengono tenuti fino a 12 settimane dopo l'iniezione del virus per consentire alla glia residente di riprogrammarsi in neuroni maturi.