JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:17 min • August 7th, 2025
Fissare un topo anestetizzato in un telaio stereotassico.
Disinfetta il cuoio capelluto rasato, quindi fai un'incisione sulla linea mediana per esporre il cranio.
Asciugare il cranio e applicare perossido di idrogeno per migliorare la visibilità del bregma.
Individua bregma e lambda, quindi identifica i siti di destinazione.
Perforare con cautela il cranio nei siti bersaglio.
Collegare la siringa piena di virus allo strumento stereotassico.
Il virus codifica Cas9 e un RNA a guida singola per l'editing del genoma nei neuroni del giro dentato, insieme a un reporter fluorescente per etichettare i neuroni infetti.
Abbassare la siringa per raggiungere il giro dentato, quindi iniettare lentamente il virus per garantire una distribuzione uniforme.
Sollevare gradualmente la siringa e ripetere l'iniezione con coordinate aggiuntive.
Mettere brevemente in pausa per evitare il riflusso, quindi ritirare lentamente l'ago.
Ripetere la procedura sull'emisfero opposto.
Infine, sutura l'incisione.
Il modello è ora pronto per ulteriori studi.
Radere la testa di un topo anestetizzato per prepararsi al sito di iniezione. Dirigere l'isoflurano al 4% nel cono del naso. Quindi, posiziona il mouse nello strumento stereotassico. Inserisci la barra del morso nella sua bocca fino a quando i suoi denti non cadono nella fessura prima di fissare le barre auricolari.
Assicurarsi che il corpo dell'animale sia sul termoforo e che il naso sia situato nel cono del naso. Quindi, confermare l'anestesia dando un pizzicotto ai piedi. Quindi, applica lacrime artificiali per lubrificare gli occhi. Successivamente, tamponare la testa rasata con iodio povidone e lidocaina.
Ora, fai una piccola incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Asciugare il cranio con un tampone e applicare perossido di idrogeno per aiutare a visualizzare il bregma. Usando un cannocchiale da dissezione, individua il bregma sul cranio e posiziona la punta del trapano sopra di esso. Impostare le coordinate stereotassiche digitali dei piani x, y e z su 0.
Per garantire che la testa sia livellata sull'asse y caudale rostrale, posizionare la punta del trapano su lambda e livellare la testa in modo che la coordinata z sia approssimativamente uguale a 0 in bregma e lambda. Per assicurarsi che la testa sia livellata lungo l'asse x, posizionare la punta del trapano sul punto medio tra bregma e lambda e misurare le coordinate z a 1 millimetro dal punto medio su entrambi i lati per assicurarsi che siano uguali.
Quindi, abbassare l'isoflurano al 2% prima di posizionare il trapano sulle coordinate desiderate e perforare attentamente il cranio. Dopo aver praticato tutti i fori, applicare la siringa piena di virus sullo strumento stereotassico. Centrare la siringa sul foro e impostare la coordinata z sul cranio su 0. Abbassare lentamente la siringa fino alla profondità z più profonda e iniziare l'iniezione a una velocità di 0,25 microlitri al minuto utilizzando un iniettore stereotassico.
Dopo che l'iniezione è stata completata alla profondità z più profonda, attendere un minuto prima di sollevarla alla coordinata successiva e ricominciare l'iniezione. Continuare questo schema fino a quando non vengono iniettate tutte le coordinate di iniezione z. Dopo l'ultima iniezione, attendere due minuti prima di rimuovere la siringa. Quindi, rimuovere il topo dallo strumento stereotassico e suturare il cuoio capelluto. Applicare lidocaina e crema antibatterica sul sito chirurgico e somministrare antidolorifici prima di trasferire l'animale in una camera di recupero riscaldata.