Patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip Bio flip
1 ottobre 2007
Abbiamo dimostrato un metodo semplice per l'immissione delle cellule nelle posizioni desiderate su un substrato. Questo metodo di modelli di cellule lanciando un chip di silicone che contiene pozzetti pieni di cellule sul substrato. Questo metodo fornisce un nuovo metodo per modulare la segnalazione diffusibile e juxtacrine tra le cellule.
Sono Nickel Mital. Sono uno studente laureato nel laboratorio di Bowman. Oggi parlerò di un dispositivo sviluppato da due ex studenti del nostro laboratorio, chiamato bio flip chip.
E questo dispositivo consente il rilascio di cellule su un substrato scelto dall'operatore e in una configurazione anch'essa scelta dall'operatore. Il dispositivo in sé, ne abbiamo uno qui, è molto semplice. Consiste fondamentalmente in piccole pozzette ricavate in un pezzo di silicone.
Ogni pozzetto è solitamente progettato per contenere una singola cellula, ma se necessario, possiamo ovviamente realizzarli più grandi. La fabbricazione del dispositivo è realizzata in modo che i pozzetti abbiano la stessa disposizione che le cellule assumeranno alla fine sul substrato. Pertanto, il dispositivo stesso viene realizzato utilizzando la litografia con materiali morbidi.
In particolare, utilizziamo PDMS, ovvero poli dimetil silossano, e lo modelliamo a partire da una piastrina di silicio. Ne abbiamo una qui. La piastrina stampo è realizzata mediante una fotolitografia standard per definire un fotoresist SUA, che viene depositato sulla piastrina di silicio mediante centrifugazione.
Quindi, in sintesi, le cellule vengono trasferite sul substrato prescelto riempiendo semplicemente i pozzetti del bio flip chip con queste cellule. Successivamente, applichiamo il chip al substrato desiderato, spesso una cultura cellulare in polistirene. Infine, capovolgiamo l'insieme, permettendo alle cellule di fuoriuscire dai pozzetti e di depositarsi sul substrato.
Sono Stephanie Flavin. Sono una ricercatrice undergraduate nel laboratorio Goldman, e oggi mostrerò come utilizzare il bio flip chip per creare un modello cellulare il giorno precedente. Vogliamo eseguire un esperimento di patterning.
Procederemo a incollare al plasma il PDMS su un vetrino di dimensioni di un pollice per un pollice. Successivamente, lasceremo in ammollo il chip per tutta la notte, con il pozzetto rivolto verso il basso, in una soluzione di PBS. Inoltre, taglieremo delle guarnizioni da utilizzare nell'esperimento di patterning e prepareremo delle graffette da usare allo stesso scopo.
Applicare 200 microlitri di BSA sulla superficie di ogni chip. Agitare la superficie del chip con la punta della pipetta per eliminare le bolle e permettere alla soluzione di BSA di riempire le pozzette. Lasciare i chip sotto cappa per un'ora sotto luce UV, come di consueto.
Dopo un'ora aspirare la soluzione di BSA dalle chip e risciacquare ogni chip con 200 microlitri di PBS; applicare quindi 200 microlitri di soluzione cellulare di passaggio a una densità di 10 alla sesta cellule per millilitro. Dopo aver atteso da cinque a dieci minuti affinché le cellule cadano nei pozzetti, risciacquare la superficie della chip con PBS. Inclinare la chip verso un angolo di circa 15 gradi e pipettare lentamente la soluzione cellulare dall'angolo inferiore della chip.
Riportare il chip in posizione orizzontale e aggiungere lentamente 50 microlitri di PBS all'angolo superiore. Ripetere il passaggio di lavaggio tutte le volte necessarie. Una volta rimossi gli xls dalla superficie del chip, aggiungere circa 50 microlitri di mezzo alla guarnizione interna della piastra.
Aggiungere il mezzo nella parte superiore di ogni chip. Successivamente, capovolgere la piastra e inclinarla abbassandola sulla superficie del chip, partendo da un angolo. Quindi appiattire la piastra sul chip in modo da evitare la formazione di bolle tra la piastra e il chip.
Aggiungere clip di fissaggio su ciascun lato del chip per bloccarlo in posizione. Rimuovere le maniglie da ciascun clip in modo che, quando il chip viene capovolto, si appoggi in piano sulla piastra. Spostare il chip nell'incubatore e capovolgerlo rapidamente, evitando ogni movimento non necessario.
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Panoramica
Questo studio presenta un nuovo metodo per posizionare le cellule su un substrato utilizzando un dispositivo chiamato bio flip chip. Ribaltando un chip in silicone con micropozzetti riempiti di cellule sul substrato, i ricercatori possono controllare efficacemente il posizionamento cellulare, migliorando la modulazione della segnalazione tra le cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Bioingegneria
Sfondo
- Il posizionamento delle cellule è cruciale per lo studio delle interazioni cellulari.
- I metodi attuali possono mancare di precisione nel posizionamento cellulare.
- Il bio flip chip offre una soluzione semplice ed efficace.
- Questa tecnica può influenzare sia il segnale diffusibile che quello giuntacrino.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per il posizionamento delle cellule su substrati.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di segnalazione cellulare.
- Fornire uno strumento per i ricercatori in vari campi biologici.
Metodi Utilizzati
- Progettazione e fabbricazione del bio flip chip.
- Riempimento dei micropozzetti con cellule.
- Ribaltamento del chip sul substrato desiderato.
- Osservazione e analisi del posizionamento cellulare e del segnale.
Risultati principali
- Posizionamento con successo delle cellule in posizioni mirate.
- Miglioramento della modulazione del segnale cellulare.
- Dimostrazione della facilità d'uso del dispositivo.
- Applicazioni potenziali in diverse configurazioni sperimentali.
Conclusioni
- Il biochip a inversione è uno strumento innovativo per il posizionamento delle cellule.
- Questo metodo può influenzare in modo significativo gli studi sui segnali cellulari.
- La ricerca futura potrà ampliare questa tecnica per applicazioni più ampie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il controllo spaziale preciso delle popolazioni cellulari permette un'analisi meccanicistica dei percorsi di segnalazione diffusibili e di tipo juxtacrine, fondamentali per la validazione degli obiettivi nei modelli di malattia basati sulle cellule staminali. Il Bio Flip Chip fornisce un metodo indipendente dal substrato e che preserva la chimica per ottenere configurazioni definite di microambienti cellulari, supportando lo sviluppo riproducibile di saggi per lo screening fenotipico. Questo approccio aumenta l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta riducendo la variabilità nei contatti cellula-cellula e nell'esposizione ai fattori paracrini, migliorando così la continuità traslazionale dai modelli in vitro alla validazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente la verifica di ipotesi su come la densità cellulare localizzata e la disposizione spaziale influenzino i percorsi di differenziazione e autorenovazione delle cellule staminali.
- Valore operativo: Elimina la variabilità stocastica derivante dalla semina casuale, garantendo segnali juxtacrina e paracrina costanti tra i replicati.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione del rischio meccanicistica isolando il contributo dei segnali dipendenti dal contatto rispetto a quelli solubili negli studi di interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera matrici di cellule quantificabili e spazialmente definite, compatibili con l'analisi ad alto contenuto e letture multiplex.
- Valore operativo: Consente la standardizzazione dei saggi di interazione tra cellule su polistirene per colture cellulari, vetro, Matrigel e strati di cellule di supporto, senza alterare la chimica del substrato.
- Scalabilità: Compatibile con la stampa mediante microcontatto per creare schemi di matrice extracellulare, consentendo un controllo combinatorio dei segnali di adesione e di segnalazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Indirizza le cellule staminali embrionali in nicchie definite per modellare vie di segnalazione dello sviluppo pertinenti ai disturbi congeniti e alla medicina rigenerativa.
- Modellizzazione Preclinica: Permette l'analisi dose-risposta di morfogeni o terapie in microambienti spazialmente controllati, migliorando la rilevanza fisiologica.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Riduce i falsi positivi nell'identificazione dei composti promettenti minimizzando il rumore derivante dall'aggregazione cellulare non controllata o dalla frequenza variabile di contatto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il Bio Flip Chip si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo un patterning riproducibile delle cellule staminali prima dell'esposizione al composto, sostenendo schermate guidate da ipotesi e analisi meccanicistiche successive nell'ottimizzazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Verifica in che modo l'organizzazione spaziale definita delle cellule staminali embrionali modula la specificazione delle linee cellulari e l'attività delle vie di segnalazione.
- Screening: Fornisce substrati cellulari standardizzati e riproducibili per valutare gli effetti di composti sui segnali dipendenti dal contatto e su quelli diffusibili.
- Analisi: Permette la mappatura spaziale quantitativa dell'espressione dei marcatori, della proliferazione e dell'apoptosi come variabili dipendenti in colture co-organizzate.
- Ricerca traslazionale: Modella cascate di segnalazione dello sviluppo umano in sistemi con controllo spaziale per guidare la selezione di bersagli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma modulare di patterning adattabile a diversi tipi cellulari, substrati e configurazioni della matrice extracellulare in vari progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo riducendo il rumore biologico derivante da interazioni cellulari non controllate.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del saggio attraverso un posizionamento preciso delle cellule definito dall'utente, indipendentemente dalla variabilità delle tecniche di semina.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento o interruzione progettuale potenziando il rapporto segnale-rumore nei test fenotipici mirati alla comunicazione intercellulare.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio di modulatori di vie giuntocrine (ad esempio, Notch, Wnt) in aree patologiche mediate dalle cellule staminali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella litografia morbida e nella manipolazione del PDMS per la fabbricazione o l'approvvigionamento del chip.
- Richiede l'accesso a strumentazione per il bonding al plasma e trattamento UV/ozono per la preparazione del substrato.
- Necessita di protocolli standardizzati per la preparazione e il lavaggio delle cellule per garantire un efficiente caricamento e rilascio nelle camere.
- L'adattamento a matrici 3D o a sistemi microfluidici potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei tempi di ribaltamento e dell'energia superficiale.
- Limite pratico: L'occupazione delle camere deve essere determinata empiricamente per ogni tipo e dimensione cellulare per evitare il caricamento multiplo in camere progettate per singola cellula.
