Name: Patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip Bio flip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:21:11.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Scopri il posizionamento preciso di cellule staminali embrionali utilizzando il bio flip chip in silicone con micropozzi. Questa tecnica innovativa migliora il controllo dei segnali cellulari in biologia e bioingegneria.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere EB007278.

Fare un BFC BFCs sono realizzati per stampaggio polidimetilsilossano (PDMS) su un &quot;4 wafer di silicio maestro. Fare un wafer maestro <ol><li> Inizia la disidratazione wafer silicio per 30 minuti a 130 ° C. </li><li> Posizionare la cialda su uno spin-verniciatore, versare SU8-2050 (MicroChem) sul wafer, rampa da 300 giri / s di 3000-4000 giri al minuto, e far girare per 30 s per produrre altezze caratteristica di 40-30 mm, rispettivamente. </li><li> Dopo la filatura, posizionare il wafer su una piastra a 65 ° C, immediatamente rampa fino alla temperatura di 95 ° C per 5-6 minuti, e poi rampa di discesa a 65 ° C. </li><li> Esporre il wafer ad una dose UV di 200 mJ / cm 2 su un assetto contatto con un campo scuro maschera. </li><li> Posizionare il wafer su una piastra a 65 ° C, immediatamente rampa fino alla temperatura di 95 ° C per 4-5 minuti, e poi rampa di discesa a 65 ° C. </li><li> Sviluppare le cialde in acetato PM e isopropanolo. </li><li> Silanize le cialde per 30 minuti utilizzando esametildisilossano (Shin-Etsu MicroSi), oppure (Tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (t2492-KG, Specialità UCT, Bristol, PA), per evitare di PDMS aderendo alla wafer maestro Si. </li></ol> Stampaggio chip <ol><li> Mix PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) in un rapporto di 10:1, versatelo sopra il wafer di silicio maestro (~ 15 g per wafer), e lasciarlo curare tutta la notte a temperatura ambiente. </li><li> Sbucciare le PDMS curato fuori dal wafer di Si e tagliare ogni chip con una lama di rasoio. </li><li> Legame ogni chip ad un vetrino da microscopio 1x1 centimetri taglio per una facile movimentazione. </li></ol> Preparazione del BFC per l&#39;uso <ol><li> Mettere a bagno durante la notte BFC in PBS al fine di prevenire l&#39;assorbimento del supporto nella PDMS durante l&#39;esperimento. </li><li> Asciugare il chip con un Kimwipe (Kimtech Scienza). </li><li> Mettere una goccia di 7,5% di albumina sierica bovina (BSA) (~ 200 mL) sulla superficie modellata del BFC, e poi raschiare con un puntale per disperdere la BSA ed eliminare eventuali bolle dai pozzetti. </li><li> Lasciare la BSA sulla superficie BFC per almeno 0,5 ore. Idealmente agitare la BSA ogni 15 minuti per evitare formazione di croste. </li><li> Per il montaggio del BFC all&#39;interno di un piatto 35x10 millimetri TCPS (Falcon, 35-3001), tagliare i cerchioni di un modo TCPS mezzo piatto in modo che la ¾ &quot;clip legante (Office Depot) si adatta sopra il bordo piatto per il bloccaggio del chip e piatto insieme. </li><li> Tagliare una guarnizione distanziale (struttura a forma di 20&#39;20 con bordo esterno millimetri, 15&#39;15 millimetri bordo interno, e 250-500 mm di spessore) da un foglio di PDMS (Prodotti speciali in silicone) o silicone, e applicarlo al piatto con delle pinzette. </li></ol> Cellule patterning con un BFC <ol><li> Sterilizzare il piatto, la guarnizione, BSA rivestite chip, e 2 clip legante ai raggi UV per 1 minuto. </li><li> Aspirare la BSA e risciacquare il BFC due volte con 200 ml di PBS. </li><li> Aggiungere la gelatina al piatto TCPS taglio, se necessario per il vostro cellulare-line. In caso contrario, bagnare la superficie TCPS con alcuni mezzi di comunicazione prima di applicarlo al chip (vedi sotto). Questo impedisce la formazione di bolle nella camera. </li><li> Dopo aspirare il PBS, pipetta 200 ml di soluzione delle cellule (~ 1 × 10 6 cellule / ml) sulla superficie BFC. Lasciate che le cellule accontentarsi di 5-10 min. </li><li> Inclinare il BFC a un angolo ad un angolo di circa 15 ° e lentamente pipetta la soluzione di cellule con una pipetta 200 ml. Poi, posizionare il piatto BFC e aggiungere 100 ml di PBS o supporti vergini fino all&#39;angolo opposto BFC. Sciacquare il BFC in questo modo un ulteriore 2-4 volte, se necessario, per eliminare tutte le cellule dalla inter-e regioni. </li><li> Pipettare 200 ml di media sulla superficie del chip. Aspirare gelatina / supporto dal TCPS. Poi invertire la pre-bagnato piatto e spingere lentamente l&#39;alto BFC, nel piatto. </li><li> Applicare un legante clip di ciascuno, ai due lati della camera per sigillarla. Togliere le punte di metallo dalle clip legante in modo che resti piatto livello quando capovolto. </li><li> Infine, capovolgere rapidamente la configurazione sopra evitando movimenti inutili, e metterlo in incubatrice. </li></ol>

<ol><li>Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+Chip+for+Controlling+the+Stem+Cell+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment.</a> Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).</li>
</ol>

Anche se il protocollo e il video qui descritto l&#39;utilizzo della BFC 1 a modello le cellule staminali embrionali di topo (mESCs), BFCs può essere usato per modello praticamente qualunque tipo di cellule di interesse. L&#39;unico cambiamento che si possano desiderare di fare è quella di modificare la dimensione dei pozzetti. Nella nostra esperienza, per usare il BFC alle cellule singolo modello di un altro tipo di cellula, un diametro di pozzetti ed altezza pari a 10 micron superiore al diametro delle cellule distaccato funzio...

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Stampo master in silicio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari</td><td>Falcon BD</td><td>35-3001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Clip per raccoglitore da 3/4&quot;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>esametildisilossano</td><td>Shin-Etsu MicroSi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuovo elemento</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-2050</td><td></td></tr><tr><td>acetato di PM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>7,5% albumina sierica bovina</td></tr></tbody></table>

patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip bio flip

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Interazioni cellula-cellula composta di segnalazione diffondibile e cellula-cellula contatto (juxtacrine segnalazione) sono importanti in numerosi processi biologici come la crescita del tumore, la differenziazione delle cellule staminali e cellule staminali auto-rinnovamento. Un certo numero di metodi esistono attualmente per modulare segnalazione cellulare in vitro. Un metodo di modulare la quantità totale di segnalazione diffusibile è quello di variare la densità di semina delle cellule in coltura. A causa della natura casuale di semina delle cellule, questo si traduce in notevoli differenze nella effettiva cellula-cellula spaziatura e la quantità di contatto cellula-cellula, e non può prescrivere l&#39;ambiente locale. Un approccio più specifico per la segnalazione cellulare modulare è quello di utilizzare gli inibitori molecolari o approcci genetici per abbattere specifiche proteine ​​di segnalazione, ma entrambi questi metodi sono più adatti per la manipolazione di un piccolo numero di molecole. Qui, dimostriamo un nuovo approccio alla modulazione cellula-cellula di segnalazione che modula l&#39;ambiente locale di un cluster di cellule mettendo un diverso numero di celle nelle posizioni desiderate su un substrato. Questo metodo fornisce un modo complementare per controllare la segnalazione locale diffusibile e juxtacrine tra le cellule. Il nostro metodo si avvale della Bio Chip Flip (BFC), un chip di silicone microfabbricazione contenente centinaia a migliaia di pozzetti, ciascuno di dimensioni a detenere un singola cella o un piccolo numero di cellule. Carichiamo il chip con le cellule semplicemente pipettando loro sulla serie di pozzi e di lavaggio delle cellule scaricato fuori l&#39;array. Il chip viene poi girato su un substrato, per cui le cellule caduta dalle fonti e sul substrato, mantenendo la loro patterning. Dopo che le cellule hanno attaccato, il chip può essere rimosso (o sinistra). Questo approccio alla patterning cellulare è unico in quanto: 1) non altera la chimica del substrato, permettendo così alle cellule di proliferare e migrare, 2) permette di patterning su qualsiasi supporto, compreso il tessuto-cultura polistirolo, vetro, Matrigel, e anche alimentatore strati di cellule, e 3) è compatibile con stampa microcontact tradizionali, permettendo la creazione di isole matrice extracellulare con cellule poste all&#39;interno quelle isole. In questo video, dimostriamo il modello delle cellule staminali embrionali di topo sul tessuto-cultura polistirolo utilizzando il BFC.

Abbiamo dimostrato un metodo semplice per l&#39;immissione delle cellule nelle posizioni desiderate su un substrato. Questo metodo di modelli di cellule lanciando un chip di silicone che contiene pozzetti pieni di cellule sul substrato. Questo metodo fornisce un nuovo metodo per modulare la segnalazione diffusibile e juxtacrine tra le cellule.

Patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip Bio flip

Le interazioni cellula-cellula, che consistono in segnalazione diffusa e contatto cellula-cellula (segnalazione giustacrina), sono importanti in numerosi processi biologici come...

Sono Nickel Mital. Sono uno studente laureato nel laboratorio di Bowman. Oggi parlerò di un dispositivo sviluppato da due ex studenti del nostro laboratorio, chiamato bio flip chip.E questo dispositivo consente il rilascio di cellule su un substrato scelto dall'operatore e in una configurazione anch'essa scelta dall'operatore. Il dispositivo in sé, ne abbiamo uno qui, è molto semplice. Consiste fondamentalmente in piccole pozzette ricavate in un pezzo di silicone.Ogni pozzetto è generalmente progettato per contenere una singola cellula, ma se necessario, possiamo ovviamente realizzarli più grandi. La fabbricazione del dispositivo è realizzata in modo che i pozzetti abbiano la stessa disposizione che le cellule assumeranno infine sul substrato. Pertanto, il dispositivo stesso viene realizzato mediante litografia con materiali polimerici morbidi.In particolare, utilizziamo PDMS, ovvero polidimetilsilossano, e lo modelliamo a partire da una piastrina di silicio. Ne abbiamo una qui. Il wafer stampo è realizzato mediante fotolitografia standard per definire un resist foto-sensibile SUA, che viene depositato per centrifugazione sulla piastrina di silicio.Quindi, in sintesi, le cellule ve

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Biologia

Micro-scala di Ingegneria di biologia cellulare

Descriviamo metodi photobleaching tra cui Recovery fluorescenza Dopo photobleaching (FRAP) e Perdita Fluorescence In photobleaching (FLIP) per monitorare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in staminali embrionali (ES) cellule. Cromatina proteine ​​dinamica, che è considerato uno dei mezzi per studiare la plasticità cromatina, è aumentata in cellule pluripotenti.

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità intrinseca di differenziare e di auto-organizzarsi in schemi dei tessuti distinti; anche se questo richiede la presentazione di gradienti spaziali ambientali. Presentiamo stencil micropatterning come metodo semplice e robusto per generare gradienti biochimici e meccanici per controllare modelli differenziazione HPSC.

Stencil micropatterning di cellule staminali umane pluripotenti per Probing spaziale Organizzazione di differenziazione Fates

Qui, descriviamo i metodi per eseguire ChIP-Seq e CARIP-Seq, compresa la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, per generare globale epigenomic e cromatina-associated RNA mappe in cellule ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali

Questo protocollo dettagliato fornisce una descrizione dettagliata della messa a punto sperimentale e analisi dei dati per la valutazione delle risposte infiammatorie in hiPSC-ECs e l'analisi di adesione del leucocita sotto flusso fisiologico.

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Il metodo qui presentato utilizza il micromodellamento insieme all'imaging quantitativo per rivelare l'organizzazione spaziale all'interno delle culture dei mammiferi. La tecnica è facile da stabilire in un laboratorio di biologia cellulare standard e offre un sistema trattabile per studiare patterning in vitro.

Mappatura dell'Emergente Organizzazione Spaziale delle Cellule Mammarie utilizzando Micropatterns e Quantitative Imaging

I ligandi a matrice extracellulare possono essere modellati su idrogel di poliacrilammide per consentire la coltura di cellule staminali embrionali umane in colonie confinate su substrati conformi. Questo metodo può essere combinato con la microscopia a forza di trazione e i saggi biochimici per esaminare l'interazione tra la geometria dei tessuti, le forze generate dalle cellule e le specifiche del destino.

Modellazione della geometria delle colonie di cellule staminali embrionali umane su substrati conformi per controllare la meccanica a livello di tessuto

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Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

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Generazione di un chip di barriera emato-encefalica basata sull'iPSC umano

Questo articolo presenta metodi per coltivare miociti cardiaci con forme diverse, che rappresentano diverse patologie, e ordinare questi miociti cardiaci aderenti in base alla loro morfologia a un singolo livello cellulare. La piattaforma proposta fornisce un nuovo approccio all'elevata produttività e allo screening farmacologico per diversi tipi di insufficienza cardiaca.

Un approccio per studiare la trascritomica dipendente dalla forma a un singolo livello cellulare

Qui presentiamo un protocollo alle cellule micropattern a risoluzione monocellulare utilizzando l'adesione programmata dal DNA. Questo protocollo utilizza una piattaforma di fotolitografia da banco per creare modelli di oligonucleotidi del DNA su un vetrino e quindi etichetta le membrane cellulari con oligonucleotidi complementari disponibili in commercio. L'ibridazione degli oligos si traduce in adesione cellulareprogrammata.

Modellazione semplice, economica e modulare delle cellule utilizzando il DNA

Scopri il posizionamento preciso di cellule staminali embrionali utilizzando il bio flip chip in silicone con micropozzi. Questa tecnica innovativa migliora il controllo dei segnali cellulari in biologia e bioingegneria.

Patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip Bio flip

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