Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina
12 gennaio 2012
Un metodo semplice e pratico per determinare il grado di accoppiamento tracciante gap junction tra i neuroni della retina è descritta. Questa tecnica permette di studiare la funzione delle sinapsi elettrica tra i neuroni della retina intatta in condizioni di illuminazione diverse e in momenti diversi del giorno e della notte.
L'obiettivo generale del seguente esperimento di caricamento del taglio è quello di esaminare l'entità dell'accoppiamento del tracciante della giunzione gap tra i neuroni nella retina intatta in condizioni di illuminazione controllata. Il primo passo si ottiene tagliando le retine con una lama affilata immersa in una soluzione di neurobiotina, una molecola tracciante che può diffondersi attraverso i canali di giunzione aperti, ma non le membrane cellulari. Nella seconda fase, le retine vengono incubate nella soluzione di ringer, che consente la diffusione del tracciante attraverso canali di giunzione open gap.
Se l'accoppiamento della giunzione gap è debole, la fluorescenza della neurobiotina sarà limitata ai neuroni retinici che si trovano vicino al taglio. Al contrario, se l'accoppiamento della giunzione gap è forte, la fluorescenza sarà rilevata nei neuroni retinici lontani dal taglio. Il vantaggio principale del carico di taglio rispetto alle tecniche esistenti è che è più facile da eseguire su neuroni con piccoli corpi cellulari nel tessuto retinico neurale intatto.
È anche più facile controllare le condizioni di illuminazione durante il carico di taglio rispetto a uno studio elettrofisiologico di singoli neuroni in tessuto retinico intatto. Poiché gli stimoli luminosi utilizzati durante la registrazione elettrica possono portare a cambiamenti nell'accoppiamento della giunzione gap, a dimostrare la tecnica sarà il Dr.Chu Choi, un postdoc del mio laboratorio. In questa procedura, un pesce rosso viene tenuto al buio costante durante il giorno per almeno un'ora prima dell'intervento chirurgico e tutti i passaggi successivi fino a quando il tessuto retinico non viene riparato, vengono eseguiti anche durante il giorno in oscurità costante, anestetizzare profondamente il pesce rosso aggiungendo 150 milligrammi per litro di metano solfonato all'acqua dell'acquario.
Quindi sacrifica il pesce rosso secondo le linee guida federali e universitarie e rimuovi con cura i suoi bulbi oculari. Quindi, rimuovi la parte anteriore di ciascun bulbo oculare. Quindi posiziona un pezzo di carta da filtro sopra la parte posteriore dell'occhio e capovolgi la carta da filtro e l'occhio in modo che la carta da filtro si trovi sotto la parte posteriore dell'occhio.
Ora, rimuovi delicatamente la parte posteriore dell'occhio, compresa la sclera e l'epitelio pigmentato dal pesce rosso scuro adattato. Retina ha tagliato il nervo ottico con un paio di forbici sottili. Il pesce rosso neurale, orientato verso l'alto con il fotorecettore orientato verso l'alto, dovrebbe ora essere attaccato alla carta da filtro prima dell'enucleazione, mentre il pesce è sottoposto ad anestesia a cinque millilitri ossigenata da una soluzione di ringer a base di carbonato con o senza farmaco di prova a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti dopo la dissezione della retina neurale intatta dalla porzione posteriore dell'occhio.
Trasferisci le retine nei pozzetti durante l'oscurità costante. Quindi sigillare i pozzetti con paraform e lasciare incubare il tessuto per 30 minuti. Preparare 100 microlitri di soluzione tracciante sciogliendo lo 0,5% di neuro biotina in soluzione di ringer immediatamente prima di tagliare la retina.
Quindi, aggiungi la soluzione di neuro biotina in una capsula di Petri di vetro. Quindi picchiettare delicatamente la carta da filtro a cui è attaccata la retina su un tovagliolo di carta. Per rimuovere le suonerie in eccesso, immergere una lama di rasoio nella soluzione di neuro biotina e praticare un taglio radiale perpendicolare attraverso la retina e la carta da filtro.
Dopodiché, immergi nuovamente la lama del rasoio nella soluzione di neuro biotina e taglia la retina una seconda volta. Ripeti l'operazione fino a quattro tagli per retina. A questo punto, trasferire la retina in anelli freschi, con o senza farmaco in prova per 15 minuti per consentire il caricamento e la diffusione.
Lavalo tre volte con suonerie fresche, medie con o senza farmaco in prova per cinque minuti ciascuna. Quindi fissare la retina con para formaldeide al 4% in una soluzione tampone fosfato molare 0,1 molare a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, lavare la retina con PBS 0,1 molare durante la notte a quattro gradi Celsius riponendola in frigorifero il giorno successivo.
Far reagire la retina con il 2% di streptavidina Alexa 4 88 in PBS 0,1 molare e Triton X 100 allo 0,3% a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubato durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo. Lavare la retina tre volte con 0,1 molari PBS a temperatura ambiente ogni volta per 10 minuti.
Staccare la retina dalla carta da filtro in PBS. Quindi, utilizzando un pennello sottile, montare il fotorecettore della retina con il lato rivolto verso l'alto su un vetrino con mezzo di montaggio dello scudo vettoriale. Trasferire il vetrino su un microscopio confocale a scansione laser e scattare foto con la stessa risoluzione di ingrandimento e impostazioni per ogni condizione sperimentale, in modo da poter mostrare i confronti degli effetti di diverse condizioni sperimentali sull'entità dell'accoppiamento del tracciante funzionale del gap.
Ecco l'entità dell'accoppiamento del tracciante delle cellule fotorecettrici durante il giorno in costante oscurità rispetto a durante il giorno in costante oscurità in presenza di un antagonista selettivo del recettore D 2. Si noti che il taglio a rasoio in entrambe le immagini è a sinistra. Sebbene una singola immagine possa contenere tutte le celle etichettate, si consiglia di raccogliere una pila Z dell'area di interesse e di comprimerla in un'unica immagine mostrata.
Ecco l'entità dell'accoppiamento del tracciante delle cellule fotorecettrici mentre ci si muove in sequenza attraverso un tale Zack. Si noti che il taglio a rasoio in questa immagine è a destra. Per quantificare l'entità dell'accoppiamento del tracciante nel browser di immagini LSM, aprire l'immagine, quindi fare clic su Esporta e salvare l'immagine come file TIF 16 bit non compresso che la barra di scala deve essere inclusa in questa immagine TIFF utilizzando il software di immagine NIH J.
Misura l'intensità della fluorescenza della neurobiotina marcata con Alexa 4 88 da immagini a basso ingrandimento di retine montate su fori. Aprire il file TIFF utilizzando il software Image J e quindi disegnare una linea retta corrispondente alla barra della scala. Quindi, vai su analizza, imposta la scala e inserisci la distanza nota e l'unità di lunghezza.
Quindi fare clic su OK. Ora le misure di fluorescenza possono essere presentate in unità calibrate come millimetri. Successivamente, seleziona l'area di interesse utilizzando lo strumento di selezione rettangolare.
Il picco della fluorescenza deve essere posizionato sul bordo sinistro della selezione. Assicurati che non ci sia segnale fluorescente vicino al bordo destro. Fare clic su analizza e traccia il profilo per i dati di controllo diurni ottenuti in condizioni di oscurità costante.
Una curva con un decadimento esponenziale viene visualizzata da sinistra a destra. Quindi fare clic su copia nella finestra pop-up e incollarlo in Excel. Ora ci sono due colonne, una che mostra la distanza dal taglio e l'altra che mostra l'intensità della fluorescenza in funzione della distanza dal taglio.
A titolo di confronto, i passaggi precedenti vengono ripetuti con i dati ottenuti in condizioni di oscurità costante durante il giorno. In presenza di spit bro, dividere ciascun valore di fluorescenza grezzo per il valore massimo di fluorescenza per ottenere l'intensità di fluorescenza relativa. Copiare due colonne corrispondenti alla distanza dal taglio e all'intensità di fluorescenza relativa, quindi incollarle nel software di origine.
Questi passaggi vengono mostrati sia per il controllo diurno che per lo spiedo diurno. I dati di esecuzione a questo punto adattano i risultati con il decadimento esponenziale. Funzione numero uno, confronta i valori della costante spaziale in diverse condizioni sperimentali utilizzando un test T o Inova.
Per il confronto vengono mostrate le funzioni esponenziali e le analisi statistiche del controllo diurno, del pip rone diurno e dei dati di controllo notturno. Mostrato. Ecco alcuni esempi dell'estensione dell'accoppiamento del tracciante delle cellule fotorecettrici nella retina del pesce rosso adattato al buio nel giorno A, nella notte B e nel giorno in presenza di un antagonista selettivo del recettore D 2, come rivelato dalla tecnica di caricamento tagliato. Tutte le immagini confocali sono state scattate utilizzando le stesse impostazioni per il confronto.
In questo grafico, l'intensità della fluorescenza per tre condizioni sperimentali è tracciata in funzione della distanza dal taglio e adattata dalla funzione esponenziale. La tecnica del carico di taglio viene utilizzata per quantificare l'entità dell'accoppiamento del tracciante giunzionale del gap calcolando i valori della costante di spazio, come mostrato qui per tre condizioni sperimentali. La tecnica del cut loading può essere utilizzata anche per studiare le sinapsi elettriche tra altri tipi di cellule nella retina e in altre specie.
Ad esempio, queste due figure illustrano che le cellule orizzontali di coniglio, di tipo A e di tipo B mostrano un accoppiamento tracciante omologo in seguito, un carico di taglio e una diffusione della neurobiotina in condizioni di adattamento al buio. Abbiamo utilizzato la tecnica del caricamento a taglio per studiare l'entità della diffusione del tracciante attraverso le giunzioni tra aste e coni durante il giorno e la notte. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per determinare se l'accoppiamento del tracciante tra altri neuroni retinici è controllato dall'orologio retinico e/o da specifiche condizioni di luce e buio.
Può anche essere utilizzato per studiare l'accoppiamento dei traccianti tra i neuroni in altre regioni del cervello.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per determinare l'entità del accoppiamento del traceur di giunzione lacunare tra i neuroni della retina. La tecnica permette l'indagine delle sinapsi elettriche nella retina intatta in diverse condizioni di illuminazione.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia retinica
- Comunicazione cellulare
Sfondo
- Le giunzioni lacunari facilitano la comunicazione tra i neuroni.
- Comprendere il accoppiamento del traceur può rivelare informazioni sulla funzione neuronale.
- I metodi esistenti possono essere difficili per i piccoli corpi cellulari nei tessuti intatti.
- Le condizioni di illuminazione possono influenzare il accoppiamento delle giunzioni lacunari.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo conveniente per valutare il accoppiamento delle giunzioni lacunari.
- Indagare gli effetti dell'illuminazione sulle sinapsi elettriche nei neuroni retinici.
- Migliorare le tecniche esistenti per lo studio delle piccole strutture neuronali.
Metodi utilizzati
- Le retine vengono tagliate e caricate con traceur di neuro biotin.
- L'incubazione in soluzione di Ringer permette la diffusione del traceur.
- L'analisi della fluorescenza viene utilizzata per valutare la forza di accoppiamento.
- Le condizioni sperimentali sono controllate per minimizzare le influenze esterne.
Risultati principali
- L'intensità della fluorescenza indica l'entità dell'accoppiamento del traceur.
- I risultati variano in base alle condizioni di illuminazione e all'ora del giorno.
- Il caricamento tagliato si è dimostrato efficace per le piccole strutture neuronali.
- L'analisi comparativa tra diversi setup sperimentali è facilitata.
Conclusioni
- Il metodo di caricamento tagliato è uno strumento prezioso per studiare i neuroni retinici.
- Le condizioni di illuminazione influenzano significativamente il accoppiamento delle giunzioni lacunari.
- Questa tecnica può migliorare la nostra comprensione della comunicazione neuronale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Assessing gap junction-mediated communication in retinal neurons supports target validation in neuroscience drug discovery by enabling mechanistic de-risking of synaptic modulators. The cut-loading technique provides quantitative, spatially resolved tracer diffusion data under controlled illumination, improving predictive confidence in early-stage target engagement studies. This approach addresses a key technical barrier in studying small neuronal structures in intact tissue, facilitating reproducible assay development for pathway clarification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying gap junction tracer coupling as a functional readout of electrical synaptic strength.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized tracer diffusion measurements that clarify target modulation by neurotransmitters or drugs.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative space constant values that reflect coupling efficacy across experimental conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (intact retinas) with gap junction permeability suitable for downstream compound screening.
- Reproducibility: Enables standardized tracer loading and diffusion protocols under constant darkness, reducing variability from light-induced conductance changes.
- Quantitative Output: Produces fluorescence intensity profiles that can be normalized and fitted to exponential decay models for inter-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports investigation of retinal circadian regulation of gap junctions, a mechanism relevant to visual processing disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical continuity by enabling consistent assessment of tracer coupling across light/dark conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides data on modulator effects (e.g., D2 receptor antagonists) to inform go/no-go progression based on target engagement evidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of gap junction modulators prior to lead identification, with outputs directly informing target confidence and pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the effect of illumination and pharmacological agents on tracer diffusion through gap junctions.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with quantifiable tracer diffusion, supporting reliable evaluation of compound effects on neuronal coupling.
- Analytics: Generates calibrated fluorescence intensity and space constant measurements that allow statistical comparison (e.g., T-test) of coupling strength across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling assessment of tracer coupling regulation by retinal clock and light/dark cycles, relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying gap junction coupling across retinal neuron types and species, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in electrical synaptic communication.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled illumination and standardized tracer loading procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier go/no-go decisions based on quantitative target engagement data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing empirical data on modulator effects across temporal and pharmacological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection, tracer handling, and fluorescence microscopy under controlled darkness.
- Dependent on instrumentation for microcutting, incubation, confocal imaging, and fluorescence quantification (e.g., ImageJ, Origin).
- Necessitates cross-team standardization of illumination protocols, tracer concentration, and cut depth to ensure reproducible coupling measurements.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to other neuronal systems or species with varying tissue thickness and gap junction permeability.
- Practical limitations include the need for permeable tracers like neuro biotin and the inability to assess non-tracer-coupled electrical synapses directly.
