Name: Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Scopri il metodo cut-loading per analizzare l'accoppiamento dei tracer tra neuroni retinici in condizioni di illuminazione controllate. Questa tecnica facilita lo studio delle sinapsi elettriche nei tessuti neurali intatti.

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Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere EY005102 di SCM e EY018640 di RCP

1. Intatti i preparativi retina neurale per pesci rossi, topi e conigli <ol><li> Eseguire tutte le seguenti operazioni, comprese quelle descritte nella "2) Cut-loading", sotto costante ambiente (sfondo) illuminazione. Si prega di notare che ai fini del presente protocollo, le procedure sono descritti come eseguita nel buio costante (cioè sotto molto scuro (ad esempio "scotopica") condizioni ≤ 0,0001 lux), utilizzando occhiali per la visione notturna a infrarossi, ma gli altri livelli di intensità maggiore di costante illuminazione ambientale può essere invece utilizzata per determinare l'effetto di altri livelli di illuminazione ambientale sull'accoppiamento gap junction tracciante. </li><li> Dark-adattare la sperimentazione animale (pesci rossi, mouse o di coniglio) per almeno 1 ora prima dell'intervento chirurgico. </li><li> Come descritto in precedenza 7, profondamente anestetizzare pesci rossi mettendoli in tricaine metanosolfonato (MS222, 150 mg / L di pesci d'acqua tamponata (bicarbonato di sodio contenenti) serbatoio), e profondamente anestetizzare topi con ketamina (100 mg/ Kg, ip) e rompun (10 mg / kg, ip). Profondamente anestetizzare conigli con uretano (dose di carico: 2,0 g / kg, ip) e anche usare l'anestesia locale intraorbital (2% Xylocaine), come descritto in precedenza 8. Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono la cura e l'uso di animali deve essere effettuata conformemente alle linee guida federali ed essere esaminato e approvato dalla locale università e la cura degli animali comitati uso. (Nota:. Negli esperimenti descritti qui, tutte le procedure sperimentali che coinvolgono la cura e l'uso di pesce, topi e conigli sono stati eseguiti in conformità con le linee guida NIH e sono stati esaminati e approvati da Ohio State Cura degli animali dell'Università istituzionale e Comitato Usa) </li><li> Per i pesci, topi e conigli, a seguito di enucleazione, rimuovere la parte anteriore di ogni bulbo oculare. Poi, posto un pezzo di carta da filtro in cima alla parte posteriore dell'occhio ed invertire la carta da filtro e l'occhio, in modo che la carta da filtro si trova sotto la parte posteriore dell'occhio. Quindi, utilizzando beneforcipe sezionare la retina neurale intatta dalla parte posteriore dell'occhio con delicatezza peeling via dell'epitelio pigmentato / coroide / sclera, che sono attaccati l'uno all'altro, dalla retina neurale, che è collegato alla carta da filtro. Poiché si tratta di fatto, tagliato il nervo ottico con sottile molla forbici. La retina neurale, orientato fotorecettori rivolta verso l'alto, ora dovrebbe essere allegato alla carta da filtro e separato dal resto dell'occhio. </li></ol> 2. Cut-loading <ol><li> Immergere la retina in una soluzione ossigenata Ringer (Tabella 1) in un 6-pozzetti (~ 5 mL / pozzetto) per 30 minuti in ambiente costante (sfondo) illuminazione (ad esempio sotto molto scuro (ad esempio "scotopica") condizioni) con o senza un test di droga. Mantenere la retina pesce in ossigenato (5% di CO 2 / 95% O 2) bicarbonato-based di Ringer a 22 ° C, tenuta il 6-pozzetti con parafilm e mantenere la retina topo e di coniglio a 36 ° C in un CO 5% 2 / 95% O <li> Preparare la soluzione tracciante (tipicamente 100 mL), sciogliendo neurobiotin (0,5%), una molecola biotinilato, in soluzione di Ringer subito prima di tagliare attraverso la retina. Si noti che lo 0,5% rodamina destrano (alto (&gt; 10.000) MW) può essere aggiunto alla soluzione. Grazie al suo elevato peso molecolare, rodamina destrano non attraversa giunzioni gap e solo le cellule etichette che sono state danneggiate dal taglio. Come mostrato in fig. 3, questo è un modo utile per distinguere le cellule che si sono accumulate neurobiotin perché sono stati feriti, da quelli che hanno accumulato il tracciante per diffusione attraverso giunzioni gap. </li><li> Posizionare la soluzione neurobiotin su un vetro (o plastica) capsula di Petri, toccare la carta da filtro, a cui è collegata la retina, su un tovagliolo di carta per rimuovere l'eccesso Ringer, immergere una lama di rasoio (o altro lama tagliente) nella soluzione neurobiotin e iln un taglio radiale attraverso la retina e la carta da filtro. Se si preferisce, distanziali può essere utilizzato in modo che il taglio è fatto attraverso la retina, ma non la carta da filtro. Il taglio deve essere orientato perpendicolarmente alla superficie della retina. Immergere la lama nella soluzione neurobiotin nuovo e tagliare la retina una seconda volta. Ripetere questa operazione fino a 4 tagli al retina (vedi fig. 1). Utilizzare un microscopio da dissezione quando tagli rasoio tramite mouse e altri piccoli retine. </li><li> Come mostrato in fig. 1, immergere la retina di nuovo nel medio Ringer fresco, con o senza droga test, con un 6-pozzetti (5 ml Ringer / pozzetto). Incubare la retina per 15 minuti per consentire il carico e diffusione. </li><li> Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con media Ringer fresco, con o senza droga test. </li><li> Fissare la retina con 4% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare con 0,1 M PBS notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno seguente, reagire with 2% streptavidina-Alexa 488 (concentrazione finale 10 mg / mL) in PBS 0,1 M + 0,3% Triton X-100, e mantenere una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare tre volte per 10 minuti ciascuno con 0,1 M PBS a RT </li><li> In PBS, staccare la retina dalla carta da filtro e poi, usando un pennello fine, luogo della retina, fotorecettori-orientato verso l'alto, in una diapositiva. </li><li> Delicatamente il montaggio di media Vectashield montaggio (Vector Laboratories, Burlingame, CA). </li><li> Scatta foto con un microscopio confocale a scansione laser (per esempio, Zeiss 510 META) allo stesso ingrandimento, la risoluzione e le impostazioni per ogni condizione sperimentale, in modo da poter confrontare gli effetti delle diverse condizioni sperimentali (farmaci di prova per esempio, condizioni di illuminazione) sul grado di gap di giunzione tracciante di accoppiamento (Fig. 2A-C e fig. 4A-C). Anche se una sola immagine può contenere tutte le cellule etichettate, si consiglia di raccogliere un Z-Stack della zona di interesse e comprimerla in un unicoimmagine. </li></li></ol> 3. Quantificazione del tracciante giunto con ImageJ <ol><li> Nel browser di immagine LSM, aprire l'immagine, fare clic su Esporta e salvare l'immagine come TIF-16 bit non compresse dei file. Barra di scala dovrebbero essere inclusi in questa immagine TIF. </li><li> Utilizzando il software ImageJ NIH, misurare l'intensità di fluorescenza di Alexa-488-etichettati neurobiotin a basso ingrandimento immagini di tutto il montaggio retine. Aprire il file TIF utilizzando il software ImageJ e quindi disegnare una linea retta corrispondente alla barra della scala. Vai a ANALIZZARE, SET SCALA e immettere la distanza conosciuta e unità di lunghezza, quindi fare clic su OK. Ora i risultati delle misurazioni possono essere presentati in unità calibrate, come ad esempio millimetri. </li><li> Selezionare l'area di interesse utilizzando lo strumento selezione rettangolare. Il picco di fluorescenza dovrebbero essere posizionati al bordo sinistro della selezione. Assicurarsi che non vi è alcun segnale di fluorescenza vicino al bordo destro. In caso contrario, ruotare l'immagine attiva (IMAGE, poi ruotate). </li><li> CliccareANALIZZARE e PLOT PROFILO. Si dovrebbe vedere una curva con un decadimento esponenziale da sinistra verso destra. </li><li> Clicca COPIA nella finestra pop-up e incollarlo in Excel. Ora si vedono due colonne che mostra la distanza dal taglio (colonna a sinistra) e l'intensità di fluorescenza in funzione della distanza dal taglio (colonna destra). </li><li> Dividere ogni valore grezzo di fluorescenza per il valore massimo di fluorescenza di ottenere l'intensità relativa di fluorescenza. </li><li> Copiare due colonne corrispondente alla distanza dal taglio (X) e l'intensità di fluorescenza relativa (Y), e quindi incollarli in un software di origine. </li><li> Montare con il decadimento esponenziale # 1 funzione (Fig. 2D e Fig. 4D.), Che è nella forma: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) dove Y è l'intensità relativa della fluorescenza, Y o è la fluorescenza di fondo, Y max è la fluorescenza massimo relativo, λ è la space (lunghezza) costante, e x è la distanza dal taglio. </li><li> Confrontare la costante di spazio (λ) valori a diverse condizioni sperimentali utilizzando il t-test o ANOVA (2E Fig. e fig. 4E). Si noti che le tecniche alternative di quantificazione sono stati descritti da altri 13,14. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Esempi rappresentativi di tracciante cellule fotorecettori accoppiamento come determinato dal taglio di carico sono presentati nelle Figure 2 e 3 (pesce) e la figura 4 (coniglio). Confocale immagini sono state scattate utilizzando le stesse impostazioni per il confronto (Fig. 2A-C e fig. 4A-C) e l'intensità di fluorescenza è stata tracciata in funzione della distanza dal taglio e montato dalla funzione esponenziale mostrato in n. 3,8 sopra (Fig. 2D e fig. 4D). Valori di spazio costante per ogni condizionesono illustrati nelle figure 2E e 4E, dimostrazione del fatto che il grado di accoppiamento gap junction tracciante può essere quantificato utilizzando la tecnica del cut-loading. Inoltre, i risultati sono altamente riproducibili. Uso del cut-loading tecnica come un mezzo per quantificare il grado di accoppiamento gap junction tracciante è anche convalidata dalla constatazione che l'intensità di fluorescenza decresce esponenzialmente in funzione della distanza dal taglio in tutti i casi esaminati 7,8 (vedi anche fig. 2D e 4D qui), indicando che neurobiotin entrati i fotorecettori attraverso il taglio rasoio e non da altri siti della retina. Inoltre, l'qualitativamente simile giorno / notte differenza di accoppiamento tracciante cellulare dei fotorecettori osservato in pesci rossi con iniezioni tracciante in coni singoli e con taglio di carico 7 sostanzia cut-carico come un mezzo relativamente accurato per misurare il grado di accoppiamento dei fotorecettori. Il cut-loading tecnica può essere utilizzata anche per studiare altri tipi di sinapsi elettriche nella retina. Per esempio, la Figura 5 mostra che il coniglio di tipo A (Fig. 5A) e di tipo B (Fig. 5B), le cellule orizzontali mostrano omologhi tracciante di accoppiamento seguenti cut-caricamento e la diffusione di neurobiotin sotto adattato all'oscurità condizioni. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> Pesce </td><td> Mouse </td><td> Coniglio </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 3,1 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> Glutammina </td><td> - </td><td> 0,1 </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Composizione delle soluzioni della suoneria per pesci rossi, mouse e retine di coniglio. Le concentrazioni sono presentati in mm. Le soluzioni di Ringer sono bollito con 5% di CO 2 / 95% O 2 e mantenuta a 22 ° C (di pesce) o 36 ° C (mammiferi). "-": Non incluso nel Ringer per questa specie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Diagramma di flusso che mostra il cut-procedura di caricamento. Dopo l'isolamento of la retina neurale intatta, numerosi tagli radiali sono state fatte da una lama che per la prima volta immersa in una soluzione neurobiotin 0,5%. La retina è stato incubato per il caricamento e la diffusione del tracciante, e poi lavato prima di fissazione con paraformaldeide 4% (PFA) in 0.1M tampone fosfato (PB). Tracciante di accoppiamento è stato esaminato con streptavidina coniugata con Alexa-488. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Giorno-notte differenza di accoppiamento dei fotorecettori tracciante nel pesce rosso è rivelata dal cut-loading tecnica. Divario di giunzione cellula fotorecettore neurobiotin tracciante accoppiamento era abbondante durante la notte (B) e nel giorno successivo all'applicazione di spiperone (10 micron), un selettivo della dopamina D 2 antagonista del recettore (C), ma non nel giorno in condizioni di controllo (A). D) normalizzato intensità relativa fluorescenza in funzione della distanza dai tagli (indicato dalle frecce in AC). E) val spazio costanteUES desunti dai dati in esperimenti D e altri (n = 4). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un esempio rappresentativo che mostra fluorescenza nello strato fotorecettore cella di una dark-adattato retina pesce rosso durante la notte seguente cut-carico con una soluzione di sia neurobiotin e rodamina destrano. Rodamina destrano (mostrato in rosso), che non si diffondono attraverso canali aperti gap junction grazie al suo elevato peso molecolare (&gt; 10.000 MW), solo le cellule etichettate vicino al taglio. Al contrario, neurobiotin (evidenziato in verde) diffusa attraverso giunzioni gap e può essere visto in cellule visive, lontano dal taglio. La posizione del taglio è indicata dalla freccia in ogni pannello. Scala grafica: 200 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Giorno-notte differisconoriferimento in fotorecettori tracciante di accoppiamento in retina di coniglio è rivelata dal cut-loading tecnica. Divario di giunzione cellula fotorecettore neurobiotin tracciante accoppiamento era abbondante durante la notte (B) e nel giorno successivo all'applicazione di spiperone (10 mM) (C), ma non nel giorno in condizioni di controllo (A). In AC, vista perpendicolare della ricostruzione 3D dei fotorecettori coniglio vicino al taglio sono mostrati. D) normalizzato intensità relativa fluorescenza in funzione della distanza dai tagli. E) i valori dello spazio costante ottenuta dai dati in esperimenti D e altri (n = 3). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Cut-loading rivela che adattato all'oscurità coniglio cellule orizzontali sono accoppiate tracciante. Sia di tipo A (A) e tipo B (B), le cellule orizzontali in adattato all'oscurità retine di coniglio esposti omologo neurobiotin accoppiamento tracciante.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il cut-loading metodo qui descritto è una tecnica utile e semplice per determinare il grado di accoppiamento tracciante divario di giunzione tra i neuroni della retina in condizioni di illuminazione diverse e in momenti diversi del giorno e della notte. I vantaggi di questa tecnica sono la possibilità di quantificare l&#39;entità di accoppiamento tracciante gap junction tra i neuroni nel tessuto retinico intatto sotto una varietà di condizioni di illuminazione durante il giorno e la notte e di farlo per i neuroni accoppiati che hanno somata di piccolo diametro. Limiti della tecnica per lo studio delle giunzioni gap in autunno tessuto intatto in due categorie generali. In primo luogo, la diffusione del tracciante attraverso giunzioni gap aperto può essere relativamente difficile da osservare a causa di una), il piccolo diametro o la carica associata con i canali aperti e b) i volumi relativi accoppiato compartimenti cellulari 1,14,15. Cioè, la diffusione del tracciante da una piccola cella a una cella più grande o gruppo di cellule accoppiate, compared alla diffusione del tracciante da una cella più grande a una cella più piccola, può essere più difficile da individuare a causa della diluizione del tracciante. In secondo luogo, in determinate condizioni fisiologiche, il grado di diffusione del tracciante attraverso giunzioni gap nel tessuto intatto potrebbero non riflettere accuratamente la forza della conduttanza divario giunzionale a causa delle differenze nella conduttanza della piccola corrente elettrica che trasporta gli ioni, rispetto alla permeabilità del tracciante relativamente grandi molecole di 1,14,15. In generale, le prove di tracciante accoppiamento suggerisce fortemente la presenza di funzionamento, canali aperti gap junction, ma in alcune condizioni fisiologiche, la diffusione del tracciante non possono, accadere o essere osservate, anche se le registrazioni elettrofisiologiche suggeriscono la presenza di funzionamento, giunzioni gap aperto. Sembra probabile che il taglio di caricamento tecnica può essere utilizzata anche per indagare il grado di accoppiamento tracciante gap junction tra i neuroni nel tessuto intatto da altre regioni del sistema nervoso centraleTEM.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Tricaine solfonato metano (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / L di acqua tamponata pesce carro armato </td></tr><tr><td> Uretano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 g / kgloading dosi </td></tr><tr><td> Doppio tubo Notte Vision Goggle </td><td> Notte Optics USA </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro di carta, N. Grado 4 </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze bene, Dumont n. 5, Biologie, 11 cm di lunghezza </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Forbici fine, a molla, 8 lama mm, dritto </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vettore </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Streptavidina coniugata con Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Destrano rodamina (alto (&gt; 10.000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield montaggio medio </td><td> Vettore </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META microscopio a scansione laser confocale </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8,0 </td><td> OriginLab Corp. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento tracer junction gap tra i neuroni della retina

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Oltre alla trasmissione sinaptica chimica, i neuroni che sono collegati da giunzioni gap può anche comunicare rapidamente via elettrica di trasmissione sinaptica. Crescente evidenza indica che giunzioni gap non solo permettono il flusso di corrente elettrica e l&#39;attività sincrona tra le cellule interconnesse o accoppiati, ma che la forza o l&#39;efficacia di comunicazione elettrica tra le cellule accoppiato può essere modulata a 1,2 in grande misura. Inoltre, il diametro interno di grandi dimensioni (~ 1.2 nm) su molti canali gap junction permette non solo il flusso di corrente elettrica, ma anche la diffusione di molecole di segnalazione intracellulare e piccoli metaboliti tra le cellule interconnesse, in modo che giunzioni gap può anche mediare la comunicazione metabolici e chimici . La forza della comunicazione giunzionale divario tra i neuroni e la sua modulazione mediante neurotrasmettitori e altri fattori possono essere studiate contemporaneamente la registrazione a partire da cellule elettricamente accoppiate e determinando tl&#39;ampiezza di diffusione di molecole traccianti, che sono divario di giunzione permeabili, ma non membrana permeabile, dopo l&#39;iniezione iontoforesi in singole cellule. Tuttavia, queste procedure possono essere estremamente difficili da eseguire sui neuroni con somata piccolo intatto tessuto nervoso. Numerosi studi sulle sinapsi elettriche e la modulazione della comunicazione elettrica sono stati condotti nella retina dei vertebrati, dal momento che ciascuno dei cinque tipi di neuroni della retina è collegato elettricamente con giunzioni gap 3,4. Crescente evidenza ha mostrato che il ritmo circadiano (24 ore), l&#39;orologio nella retina e cambiamenti di stimolazione luminosa regolare gap junction accoppiamento 3-8. Per esempio, un recente lavoro ha dimostrato che l&#39;orologio circadiano della retina diminuisce giunzione accoppiamento divario tra asta e cellule fotorecettori cono durante il giorno, aumentando l&#39;attivazione del recettore della dopamina D2, e aumenta notevolmente coni accoppiamento di notte, riducendo l&#39;attivazione del recettore D2 <sup&gt; 7,8. Tuttavia, non solo questi studi sono estremamente difficili da eseguire sui neuroni con somata piccolo intatto tessuto neurale della retina, ma può essere difficile controllare adeguatamente le condizioni di illuminazione durante lo studio elettrofisiologico di singoli neuroni della retina per evitare la luce cambiamenti indotti in gap junction conduttanza. Qui vi presentiamo un metodo diretto per determinare il grado di accoppiamento tracciante divario di giunzione tra i neuroni della retina in condizioni di illuminazione diverse e in momenti diversi del giorno e della notte. Questo taglio di caricamento tecnica è una modifica del carico raschiare 9-12, che si basa sul caricamento di colorante e diffusione attraverso canali aperti gap junction. Carico raschiare funziona bene in cellule in coltura, ma non in fette spesse, come retine intatte. Il cut-loading tecnica è stata utilizzata per studiare accoppiamento dei fotorecettori nei pesci e di mammiferi retine intatte 7, 8,13, e può essere usato per studiare accoppiamento traaltri neuroni della retina, come descritto qui.

Un metodo semplice e pratico per determinare il grado di accoppiamento tracciante gap junction tra i neuroni della retina è descritta. Questa tecnica permette di studiare la funzione delle sinapsi elettrica tra i neuroni della retina intatta in condizioni di illuminazione diverse e in momenti diversi del giorno e della notte.

Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina

Oltre alla trasmissione sinaptica chimica, i neuroni collegati da giunzioni comunicanti possono comunicare rapidamente anche tramite sinapsi elettriche...

L'obiettivo generale del seguente esperimento di carico mediante incisione è esaminare il grado di accoppiamento tramite giunzioni comunicanti tra neuroni nella retina integra in condizioni controllate di illuminazione. Il primo passaggio consiste nell'incidere le retine con una lama affilata immersa in una soluzione di neurobiotina, una molecola tracciante in grado di diffondere attraverso i canali aperti delle giunzioni comunicanti, ma non attraverso le membrane cellulari. Nel secondo passaggio, le retine vengono incubate in soluzione di Ringer, che permette la diffusione del tracciante attraverso i canali aperti delle giunzioni comunicanti.Se l'accoppiamento delle giunzioni a scambio è debole, la fluorescenza del biotina neuro sarà limitata ai neuroni retinici vicini al taglio. Al contrario, se l'accoppiamento delle giunzioni a scambio è forte, la fluorescenza sarà rilevata in neuroni retinici lontani dal taglio. Il principale vantaggio del caricamento mediante taglio rispetto alle tecniche esistenti è che è più facile da eseguire su neuroni con corpi cellulari piccoli in tessuto retinico neurale integro.È inoltre più semplice controllare le condizioni di illuminazione durante il caricamento dei frammenti rispetto a uno studio elettrofisiologico di singoli neuroni in tessuto retinico integro. Poiché gli stimoli luminosi utilizzati durante la registrazione elettrica possono essi stessi indurre cambiamenti nel coupling delle giunzioni comunicanti, a dimostrare la tecnica sarà il dott. Chu Choi, un postdottorando del mio laboratorio. In questa procedura, un pesce rosso viene mantenuto al buio costante durante il giorno per almeno un'ora prima dell'intervento chirurgico, e tutti i passaggi successivi fino alla fissazione del tessuto retinico vengono anch'essi eseguiti durante il giorno in oscurità totale; anestetizzare profondamente il pesce rosso aggiungendo 150 milligrammi per litro di metanosulfonato all'acqua dell'acquario.Quindi sacrificare il pesce rosso seguendo le linee guida federali e universitarie e rimuovere con cura i bulbi oculari. Successivamente, rimuovere la porzione anteriore di ciascun bulbo oculare. Poi posizionare un pezzo di carta da filtro sulla parte posteriore dell'occhio e capovolgere la carta da filtro e l'occhio in modo che la carta da filtro si trovi al di sotto della porzione posteriore dell'occhio.Ora, rimuovere delicatamente la parte posteriore dell'occhio, compresa la sclera e l'epitelio pigmentato, dal pesce rosso adattato al buio. Tagliare il nervo ottico con un paio di forbici fini. La retina neurale del pesce rosso, con il lato dei fotorecettori rivolto verso l'alto, dovrebbe ora essere fissata alla carta filtro prima dell'enucleazione, mentre il pesce è in anestesia, con cinque millilitri di soluzione Ringer a base di carbonato ossigenata, con o senza farmaco in esame, aggiunti in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, dopo la dissezione della retina neurale integra dalla porzione posteriore dell'occhio.Trasferire le retine nelle pozzette durante l'oscurità costante. Quindi sigillare le pozzette con paraform e lasciare che il tessuto incubi per 30 minuti. Preparare 100 microlitri di soluzione tracciante sciogliendo il 0,5% di neuro biotina in soluzione di Ringer immediatamente prima di tagliare attraverso la retina.Successivamente, aggiungere la soluzione di neuro biotina in una piastra di Petri di vetro. Poi, battere delicatamente il filtro di carta a cui è attaccata la retina su un tovagliolo di carta. Per rimuovere l'eccesso di ringer, immergere una lametta nella soluzione di neuro biotina ed eseguire un taglio radiale perpendicolare attraverso la retina e il filtro di carta.Successivamente, immergere nuovamente la lametta nella soluzione di neuro biotina e tagliare la retina una seconda volta. Ripetere fino a quattro tagli per retina. In questo passaggio, trasferire la retina in una soluzione di ringer fresca, con o senza il farmaco in esame, per 15 minuti per consentire il caricamento e la diffusione.Lavare tre volte con soluzione fisiologica fresca, mezzo con o senza farmaco in esame, per cinque minuti ciascuno. Quindi fissare la retina con paraformaldeide al 4% in soluzione tampone fosfato 0,1 M a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, lavare la retina con PBS 0,1 M durante la notte a quattro gradi Celsius, ponendola in frigorifero il giorno seguente.Fare reagire la retina con streptavidina Alexa 488 al 2% in PBS 0,1 M e Triton X-100 allo 0,3% fino a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la retina tre volte con PBS 0,1 M a temperatura ambiente, ogni volta per 10 minuti.Staccare la retina dalla carta filtro in PBS. Quindi, utilizzando un pennello fine, montare la retina con il lato dei fotorecettori rivolto verso l'alto su un vetrino con del mezzo di montaggio Vector Shield. Trasferire il vetrino su un microscopio confocale a scansione laser ed acquisire immagini alla stessa risoluzione di ingrandimento e con le stesse impostazioni per ogni condizione sperimentale, in modo da poter effettuare confronti sugli effetti di diverse condizioni sperimentali sull'estensione del coupling funzionale tramite traccianti per giunzioni comunicanti, come mostrato.Questo mostra il grado di accoppiamento tramite tracciante delle cellule fotoricettori durante il giorno in oscurità costante, rispetto al giorno in oscurità costante in presenza di un antagonista selettivo del recettore D2 della dopamina. Si noti che il taglio con il rasoio in entrambe le immagini è a sinistra. Sebbene una singola immagine possa contenere tutte le cellule marcate, si raccomanda di acquisire uno stack Z dell'area di interesse e di comprimerlo in un'unica immagine mostrata.Di seguito è riportata l'estensione del trasferimento del tracciante nelle cellule fotoricettori man mano che si procede in successione attraverso un Zack di questo tipo. Si noti che il taglio con il rasoio in questa immagine si trova a destra. Per quantificare l'estensione del trasferimento del tracciante nel browser delle immagini LSM, aprire l'immagine, quindi fare clic su esporta e salvare l'immagine come file TIF a 16 bit non compresso; la barra di scala dovrebbe essere inclusa in questa immagine TIF utilizzando il software NIH Image J.Misurare l'intensità di fluorescenza di neurobiotina marcata con Alexa 488 a partire da immagini a basso ingrandimento di retine montate su supporto circolare. Aprire il file TIFF utilizzando il software ImageJ, quindi tracciare una linea retta corrispondente alla barra della scala. Successivamente, andare su Analizza, Imposta scala e inserire la distanza nota e l'unità di lunghezza.Quindi fare clic su OK. Ora le misurazioni della fluorescenza possono essere presentate in unità calibrate, come millimetri. Successivamente, selezionare l'area di interesse utilizzando lo strumento di selezione rettangolare.Il picco della fluorescenza deve essere posizionato al bordo sinistro della selezione. Assicurarsi che non vi sia alcun segnale fluorescente vicino al bordo destro. Fare clic su analizza e traccia il profilo per i dati di controllo diurni ottenuti in oscurità costante.Viene visualizzata una curva con un decadimento esponenziale da sinistra a destra. Quindi fare clic su copia nella finestra popup e incollarla in Excel. Ora sono presenti due colonne, una che mostra la distanza dal taglio e l'altra che mostra l'intensità di fluorescenza in funzione della distanza dal taglio.Come confronto, i passaggi sopra indicati vengono ripetuti con dati ottenuti in oscurità costante durante il giorno. In presenza di spit bro, dividere ogni valore di fluorescenza grezzo per il valore massimo di fluorescenza per ottenere l'intensità relativa di fluorescenza. Copiare due colonne corrispondenti alla distanza dal taglio e all'intensità relativa di fluorescenza, quindi incollarle nel software Origin.Questi passaggi vengono mostrati sia per il controllo diurno che per il campione diurno. A questo punto, analizzare i dati adattando i risultati con una funzione di decadimento esponenziale. Confrontare i valori della costante spaziale in diverse condizioni sperimentali utilizzando un test T o ANOVA.Funzioni esponenziali e analisi statistiche dei dati di controllo diurni, di piprona diurna e di controllo notturno sono mostrate a scopo di confronto. Di seguito sono riportati esempi dell'estensione del coupling del tracciante nelle cellule fotoricettori nella retina del pesce rosso adattata al buio durante il giorno A, la notte B e durante il giorno in presenza di un antagonista selettivo del recettore D2 della dopamina, come rivelato dalla tecnica di carico mediante taglio. Tutte le immagini confocali sono state acquisite utilizzando le stesse impostazioni per permettere un confronto.In questo grafico, l'intensità di fluorescenza per tre condizioni sperimentali è riportata in funzione della distanza dal taglio ed è stata adattata mediante una funzione esponenziale. La tecnica del carico mediante taglio viene utilizzata per quantificare il grado di accoppiamento tramite giunzioni comunicanti calcolando i valori della costante spaziale, come mostrato qui per tre condizioni sperimentali. La tecnica del carico mediante taglio può essere impiegata anche per studiare le sinapsi elettriche tra altri tipi cellulari nella retina e in altre specie.Ad esempio, queste due figurelle illustrano che i neuroni orizzontali di tipo A e di tipo B nei conigli mostrano un accoppiamento omologo al tracciante dopo il caricamento mediante taglio e la diffusione di neurobiotina in condizioni di adattamento al buio. Abbiamo utilizzato la tecnica di caricamento mediante taglio per studiare l'estensione della diffusione del tracciante attraverso le giunzioni comunicanti tra bastoncelli e coni durante il giorno e la notte. Inoltre, questa tecnica può essere impiegata per determinare se l'accoppiamento al tracciante tra altri neuroni retinici è controllato dall'orologio retinico e/o da specifiche condizioni di luce e buio.È inoltre possibile utilizzarlo per studiare il coupling tramite traccianti tra neuroni in altre regioni cerebrali.

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