Somministrazione intranasale di siRNA al cervello del topo utilizzando un dispositivo di posizionamento

Inizia con topi anestetizzati posizionati su un dispositivo di posizionamento con la schiena parallela al supporto della schiena della sedia e perpendicolare al sedile.

I topi sono posizionati a testa in giù e in avanti e fissati con cinture per sedie.

Utilizzando una micropipetta caricata con un complesso peptide-siRNA che ha come bersaglio i neuroni, posizionare una goccia vicino a una narice, consentendo al topo di inalare la soluzione in modo naturale.

Premere delicatamente la testa del topo verso il basso durante l'inalazione per evitare che la soluzione defluisca nei polmoni.

Fare una breve pausa, quindi ripetere la somministrazione nell'altra narice.

Ripeti la procedura per i topi rimanenti.

Il complesso penetra nella mucosa nasale, da dove entra nei nervi olfattivo e trigemino e li attraversa per raggiungere il cervello.

All'interno del cervello, il complesso si lega ai recettori neuronali, subisce l'endocitosi e facilita la consegna intracellulare di siRNA.

Il siRNA entra a far parte del complesso RISC che, legandosi all'mRNA bersaglio, induce il silenziamento genico.

Per iniziare questa procedura, valutare il livello di anestesia del riflesso bipede del topo al fine di mantenere il piano chirurgico. Quindi, posizionare il dispositivo di posizionamento a una distanza e un'altezza adeguate per consentire un comodo accesso a tutti i reagenti necessari.

Quindi applicare l'unguento sugli occhi dell'animale. Lega un mouse con le cinture della sedia, assicurandoti che gli arti anteriori del mouse forniscano un supporto naturale mentre è in una posizione rilassata senza alcun disagio. Ripeti le procedure per i topi rimanenti. Posiziona delicatamente ogni mouse sulla sedia designata appoggiando lo schienale parallelamente al supporto dello schienale della sedia e a 90 gradi rispetto al sedile della sedia.

Lascia che l'animale si sdrai naturalmente in posizione a testa in giù e in avanti senza spingere o premere. Una volta che tutti i topi sono legati, iniziare immediatamente l'inoculazione intranasale. Per eseguire la somministrazione intranasale, caricare la micropipetta con 2 microlitri di soluzione complessa RVG9R-siRNA. Tenere la pipetta nella mano dominante e sostenerla con l'altra mano per evitare movimenti incontrollati durante la somministrazione di siRNA.

Metti circa una goccia da 2 microlitri molto vicino a una narice in modo che il topo possa inalarla direttamente. Se non si forma facilmente una piccola goccia, sostituire il puntale della pipetta con uno nuovo e ripetere l'operazione. Spingere delicatamente la testa del mouse verso il basso con il dito indice per 5 secondi durante l'inalazione e mantenere la posizione.

Per prevenire il drenaggio del farmaco nei polmoni, è importante spingere leggermente la testa del mouse verso il basso con il dito indice per 5 secondi mentre il topo sta inalando.

Avvia un cronometro per cronometrare tre o quattro minuti dopo questo per cronometrare l'inoculazione nella seconda nare del primo topo. Questo intervallo di tempo è necessario affinché il topo completi l'inalazione della prima dose e ripristini la normale respirazione. Nell'intervallo di tre o quattro minuti tra l'inoculazione di narici alternate sul primo topo, completare l'inoculazione intranasale di una nare in ciascuno dei restanti tre topi posizionati sul dispositivo.

Quando suona il cronometro, inoculare la seconda narice del primo topo e ripetere la procedura per gli altri topi come sopra. Ripetere la procedura fino a quando non vengono erogati da 20 a 30 microlitri per tutti e quattro i topi. Ci vorranno dai 30 ai 45 minuti per completare l'intera procedura di inoculazione. Rimetti gli animali nelle gabbie designate. Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.