Name: Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Scopri l'espansione su larga scala di cellule T γδ dal sangue periferico umano utilizzando zoledronato e IL-2. Questo metodo supporta l'immunoterapia cellulare autologa nel trattamento del cancro.

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1. Isolamento dei PBMC <ol><li> Prelievo di sangue (7,5-8,0 ml) in una provetta BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio. Il tubo contiene un anticoagulante eparina sodica e di un Ficoll-Hypaque densità del fluido, più una barriera di gel di poliestere, che separa i due liquidi. Centrifuga tubo / campione di sangue a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) in un rotore orizzontale (swing-out testa) per 20 minuti a 1800 x g. Interruttore centrifuga freni sbloccati. </li><li> Dopo la centrifugazione, la sequenza di strati avviene nel seguente modo (visto dall'alto verso il basso): a) al plasma - b) le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e piastrine - c) soluzione di densità - d) gel poliestere - e) granulociti - f) globuli rossi (Fig. 1). </li><li> Raccolgono una frazione dello strato di plasma, lasciando 5 a 10 mm di plasma al di sopra della interfase senza disturbare lo strato di cellule. Il plasma può essere utilizzato per la cultura (sezione 2.5). </li><li> Raccolta della frazione arricchita (PBMC) presso l'interfase con una pipetta e trasferirli in un tubo da 15 ml. </li><li> Lavare i PBMC con 10 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS), invertendo il tubo di 5 volte, quindi si centrifuga per 5 min a 400 x g. </li><li> Ripetere le fasi di lavaggio due volte, quindi risospendere il pellet cellulare in 5 ml di PBS. Determinare il numero delle cellule. Di solito 1,3 x10 6 celle vengono recuperati da 1 ml di sangue intero. </li><li> Determinare la frequenza e il fenotipo delle cellule T in γδ PBMC mediante citometria di flusso (sezione 3) (Fig. 2). </li></ol> 2. Espansione di cellule T γδ <ol><li> Centrifuga sospensioni cellulari in provette da 15 ml conica per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente, ed eliminare il surnatante. </li><li> Preparare terreno di coltura (CM) con l'aggiunta di IL-2 (IL-2) e zoledronato (Zometa) a concentrazioni finali di 1000 UI / ml e 5 mM, rispettivamente. ALyS203 (Cell Science &amp; Technology Institute) o OpTmizer (Invitrogen) supportare l'espansione dei media buona γδ cellule T (maggiori informazioni nei riferimenti 6 e 9). Zometa è fornito in forma liquida (4 fiala mg/5-ml). Per preparare una soluzione al 5 mM, aggiungere 50 ml di Zometa a 30 ml di terreno di coltura. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in terreno di coltura e regolare a 1x10 6 cellule / ml. </li><li> Pipettare 1 ml di CM contenente 1x10 6 cellule in ciascun pozzetto di una 24-pozzetti. Per le grandi culture, le cellule possono essere seminati a 0,5 x 10 6 cellule / cm 2 secondo le superfici dei pozzi piatto, piatto, o borraccia. </li><li> Aggiungi plasma autologo (sezione 1.3), pool umano AB sieri, o FCS in modo che sia circa il 10% del volume della cultura (100 microlitri per ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti). Posizionare le piastre in un umidificata 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 24-48 ore. </li><li> Mantenere la coltura ad una densità cellulare di 0,5-2 x 10 6 cellule / ml. Aggiungi terreno fresco contenente umano IL-2 (1000 UI / ml) (senza Zometa) ogni 2-3 giorni, e trasferire cellule coltivate in nuovi pozzi o fiaschi, se necessario, a seconda del grado di proliferazione cellulare (Fig. 3). Fornitura plasma o siero al mezzo in modo che la concentrazione sierica può essere mantenuto almeno l'1%. </li><li> Celle di raccolta il giorno 12-14 e determinare la, fenotipo frequenza, e le funzioni del γδ cellule T mediante citometria di flusso (vedi sotto). </li></ol> 3. L'analisi fenotipica mediante citometria di flusso <ol><li> Trasferire 200 campioni microlitri contenente 2 x 10 5 cellule a fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) tubi. </li><li> Aggiungere 2 ml di PBS freddo e centrifugare per 5 min a 400 x gr. Poi, risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer FACS (PBS + 1% di sodio azide FCS + 0,1%). Aggiungere 5 ml di ciascuna anticorpi ai campioni (gli anticorpi monoclonali sono elencati nella Tabella 1). </li><li> Incubare in ghiaccio al buio per 20 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone FACS per ogni campione, e poi vortice. Campioni Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 ° C. Con attenzione decantare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer FACS e vortice. Analizzare campioni su un citofluorimetro (Fig. 2). </li></ol> 4. IFN-γ saggio produzione 10 <ol><li> Il giorno prima del test, preparare le cellule stimolatore di coltura 3-5 x10 Daudi 5 cellule / ml in RPMI 1640 medium più 10% FCS (RPMI-10) durante la notte con Zometa (5 mM) (nel seguito denominati Z-Daudi). </li><li> Raccogliere Z-Daudi e risospendere in RPMI-10 a 2x10 6 cellule / ml. Aggiungere 100 ml di Z-Daudi (2x10 5) a ciascun pozzetto di una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti. </li><li> Preparare γδ cellule T a 2x10 6 cellule / ml in RPMI-10 contenente Brefeldin A a 20 mg / ml. Trasferire 100 ml di γδ sospensione cellulare T (2x10 5) in ciascun pozzetto contenente Z-Daudi cellule o di pozzetti di controllo (100 ml di RPMI-10 solo, o RPMI-10 con 20 ng / ml di forbolo miristato 12-13-acetato[PMA] e 2 mg / ml di ionomicina). </li><li> Mescolare pipettando su e giù parecchie volte. Incubare per 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Centrifugare la piastra per 5 minuti a 400 x g a 4 ° C e risospendere il pellet in 200 ml di PBS freddo. </li><li> Trasferire i campioni di tubi FACS. Aggiungere 4 ml di PBS freddo e centrifugare le provette per 5 min a 400 x g a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in 50 ml di buffer di FACS con FITC-coniugato anti-TCRVγ9 (5 mL) e PE/Cy5-conjugated anti-CD3 (2,5 microlitri). Incubare al riparo dalla luce per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 100 ml di reagente IntraPrep 1 e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 4 ml di PBS in ogni provetta e centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante tramite aspirazione e aggiungere 100 ml di reagente 2 IntraPrep. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. </li><li> Aggiungere 5 ml di PE-coniugato anti-IFN-γ mAb alla provetta. Incubare al riparo dalla luce per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 ml di PBS in ogni provetta e centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di tampone FACS. </li><li> Analizzare le cellule citofluorimetro. Porta il CD3 + + TCRVγ9 cellule ed esaminare l'espressione di IFN-γ (Fig. 4). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: E 'importante per determinare la percentuale di cellule T nel γδ PBMC all'inizio della cultura. Come mostrato in fig. 2 A, la percentuale dei CD3 + + TCRVγ9 γδ cellule T in PBMC è stata di 1,6% al giorno 0. Le popolazioni dominanti erano CD45RA + CD27 + CD27 + ingenuo o CD45RA - fenotipi memoria centrale. Quando γδ cellule T sono stati stimolati in modo efficiente, hanno formato grappoli nei giorni 3-5 (Fig. 3 A e B). Quando la formazione di cluster è stato ritardato, la crescita di altri tipi cellulari, quali CD4 + e CD8 + cellule T αβ o cellule NK potrebbe dominare la crescita di γδ cellule T (fig. 3 C e D). Dopo 14 giorni di cultura, la frequenza di cellule T γδ aumentato a oltre il 93,8% delle cellule coltivate in successo culture γδ cellule T (Fig. 2 E). Le colture di cellule T γδ upregulated NKG2D e CD69 espressione (fig. 2 G e H). Hanno mostrato CD27 - CD45RA - fenotipo memoria effettore (Fig. 2 F). Le funzioni di γδ cellule T sono stati valutati per quanto riguarda la produzione di citochine e citotossicità. L'IFN-γ intracellulare colorazione γδ dimostrato che le cellule T prodotte IFN-γ in risposta alla PMA / ionomicina trattamento o Z-Daudi cellule che IPP accumulato dopo il trattamento con zoledronato (Fig. 4). Questi risultati indicano che zoledronato può efficacemente stimolare e ampliare funzionale delle cellule T γδ. <table border="1"><tbody><tr><td> tubo </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> del mouse IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> del mouse IgG1 </td><td> del mouse IgG1 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Anticorpi monoclonali utilizzati in colorazione multicolore delle cellule T γδ. Un esempio di analisi fenotipica di cellule T γδ eseguiti nel nostro laboratorio è mostrato in fig. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Separazione dei PBMC. Sangue (7,5-8,0 ml) è disegnato in un tubo BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio e direttamente centrifugati per 20 min a 1800 x g. Dopo la centrifugazione, gli strati risultante come si è visto da cima a bottom: a) al plasma - b) PBMC e piastrine - c) soluzione di densità - d) gel poliestere - e) Granulociti - f) i globuli rossi. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fenotipo superficie tipica delle cellule T γδ. PBMC sono stati stimolati con zoledronato e IL-2 per 14 giorni. Le cellule sono state colorate con FITC anti-TCR Vγ9 e PE/Cy5-labeled anti-CD3 di monitorare l'espansione della γδ cellule T (A ed E). γδ cellule T sono stati identificati dalla loro espressione di TCRVγ9, e la loro espressione di CD27 e CD45RA (B e F), NKG2D (C e G), o CD69 (D e H) è stata esaminata. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Rappresentante γδ colture di cellule T. PBMC sono stati stimolati con IL-2 (1000 UI / ml) e zoledronato (5 mM). Campi rappresentativi sono visibili (IX71 microscopio invertito [Olympus] x 200). Cluster e aggregati di cellule T γδ può essere osservato il giorno 3 (A) e il giorno 5 (B), quando γδ cellule T sono state espanse con successo. Al contrario, nessun cluster o aggregati sono stati osservati quando γδ crescita delle cellule T non era adeguata (C e D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. IFN-γ produzione. γδ cellule T sono state incubate con RPMI-10 solo (A) o PMA / ionomicina (B) o Z-Daudi (C) per 4 ore. In primo luogo, espressione di superficie di TCRVγ9 era macchiato e poi IFN-γ produzione è stata esaminata dal intracellulare IFN-γ colorazione. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Cinetica di γδ colture cellulari T. (A) il numero assoluto di cellule in coltura, (B) percentuale di γδ cellule T, e (C) numero assoluto di γδ cellule T nei punti di tempo indicato.

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
<li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+cell+receptor+%CE%B3%CE%B4+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li>
<li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li>
<li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP%2FDMAPP%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li>
<li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+%CE%B3%CE%B4+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+%CE%B3%CE%B4+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li>
<li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate%2C+a+potent+stimulator+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo presentato qui permette l&#39;espansione delle cellule T efficiente γδ da PBMC. γδ cellule T attivate e ampliato da zoledronato e IL-2 sviluppano completa funzioni effettrici, riflessa dalla produzione di citochine e citotossicità. E &#39;stato riportato che il sintetico phosphoantigens pirofosfato bromohydrin (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) anche espandere le cellule T γδ, tuttavia, non sono disponibili in commercio. Al contrario, zoledronato è già concesso in licenza per le applicazioni c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> zoledronato </td></tr><tr><td> Proleukin </td><td> Novartis Pharmaceuticals </td><td></td><td> umano ricombinante IL-2 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Preparazione del tubo cellulare con sodio eparina </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203-media </td><td> Cellula Science &amp; Technology Institute </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> Un brefeldin </td><td> Sigma </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> forbolo miristato 12-13-acetato (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1MG </td><td></td></tr><tr><td> ionomicina </td><td> Sigma </td><td> 13909-1 ml </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano-CD3 FITC o PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD4-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umana CD8-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umana CD14-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD19-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD45-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umana CD56-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano TCRαβ-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano TCR Vγ9-FITC </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umana CD27-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD45RA-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano NKG2D-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFNγ-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> IgG1 isotipo di controllo-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> IgG1 isotipo di controllo-ECD o PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

espansione del sangue periferico umano γδ cellule t con zoledronato

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Γδ cellule T in grado di riconoscere e rispondere a una vasta gamma di antigeni indotta da stress, sviluppando in tal modo innato attività ampio anti-tumorale e anti-infettivi. 1 La maggior parte dei γδ cellule T nel sangue periferico hanno il recettore delle cellule T Vγ9Vδ2. Queste cellule riconoscono l&#39;antigene in un complesso maggiore di istocompatibilità modalità indipendente e sviluppare una forte funzioni citolitica e Th1-come effettore. 1 Perciò, γδ cellule T sono cellule effettrici candidato attraente per l&#39;immunoterapia del cancro. Vγ9Vδ2 cellule T rispondere a phosphoantigens come (E)-4-idrossi-3-metil-but-2-enil pirofosfato (HMBPP), che è sintetizzata nei batteri attraverso isoprenoidi biosintesi, 2 e isopentenil pirofosfato (IPP), che viene prodotto nelle cellule eucariotiche attraverso la via mevalonato. 3 In condizioni fisiologiche, la generazione di IPP ​​nella cella nontransformed non è sufficiente per l&#39;attivazione delle cellule T γδ. Disregolazione della via mevalonato nelle cellule tumorali porta all&#39;accumulo di IPP ​​e l&#39;attivazione delle cellule T γδ. 3 Poiché aminobifosfonati (come pamidronato o zoledronato) inibiscono la farnesil pirofosfato sintasi (FPP), l&#39;enzima agisce a valle di IPP ​​nella via mevalonato, i livelli intracellulari di IPP e sensitibity γδ per il riconoscimento delle cellule T possono essere terapeuticamente aumentato di aminobifosfonati. IPP accumulo è meno efficiente in cellule nontransfomred rispetto alle cellule tumorali con una concentrazione farmacologicamente rilevanti aminobifosfonati, che ci permettono l&#39;immunoterapia per il cancro attivando γδ cellule T con aminobifosfonati 4. Interessante, IPP si accumula nei monociti quando PBMC sono trattati con aminobifosfonati, a causa di efficienti assunzione di droghe da queste cellule 5. monociti che si accumulano IPP diventare cellule presentanti l&#39;antigene e stimolare Vγ9Vδ2 cellule T nel sangue periferico. 6 Sulla base di questi meccanismi, abbiamo sviluppato una tecnica per la grande espansione del γδ colture di cellule T con zoledronato e interleuchina -2 (IL-2). 7 Altri metodi per l&#39;espansione delle cellule T γδ utilizzare il sintetico pirofosfato bromohydrin phosphoantigens (BrHPP) 8 o 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) 9. Tutti questi metodi consentono ex vivo di espansione, con conseguente gran numero di γδ cellule T per l&#39;uso in immunoterapia adottiva. Tuttavia, solo zoledronato è un reagente approvato dalla FDA disponibili in commercio. Zoledronato espanso γδ cellule T CD27 schermo - CD45RA - fenotipo effettore memoria e la loro funzione può essere valutata da IFN-γ test di produzione 7.

Un metodo per espandere γδ cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è descritta. PBMC cellule derivate γδ T vengono stimolati e ampliati con zoledronato e interleuchina-2 (IL-2). L&#39;espansione su larga scala di γδ cellule T possono essere applicate a autologo immunoterapia cellulare del cancro.

Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Le cellule T $\gamma\delta$ umane possono riconoscere e rispondere a un'ampia varietà di antigeni indotti dallo stress, sviluppando così una risposta antitumorale innata e ampia e...

In questo video viene illustrata l'espansione su larga scala di cellule T gamma delta del sangue periferico umano mediante l'uso di zoledronato. Inizialmente, il sangue intero viene sottoposto a centrifugazione su gradiente di densità per isolare le cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC. Le PBMC vengono stimolate con zoledronato per indurre la trasformazione dei monociti in cellule presentanti l'antigene e contemporaneamente con IL-2 per attivare le cellule T gamma delta.Le cellule vengono incubate fino a 14 giorni al fine di favorire la proliferazione delle cellule T gamma delta. L'analisi della coltura mediante citometria a flusso dimostra che la maggior parte delle cellule raccolte presenta un fenotipo CD3 positivo e Vγ9 positivo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che il farmaco è già autorizzato per applicazioni cliniche con Zometa.Pertanto, un reagente affidabile è facilmente disponibile per la preparazione clinica di cellule T gamma delta, dimostrando che la procedura sarà di coltura cellulare makoto condo e amichi izumi. I tecnici del mio laboratorio iniziano questa procedura isolando le cellule mononucleate del sangue peri

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Immunologia e Infezioni

Espansione ex vivo di tumore cellule T reattive per mezzo di 1/Ionomycin Bryostatin e il Comune catena gamma Citochine Formulazione

Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente e purificare un gran numero di cellule NK e valutare la loro funzione.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un in vitro umano modello preclinico di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico in coltura con linee cellulari di cancro al seno per simulare l'interazione cellula-osteoclasto cancro. Il modello potrebbe essere utilizzato per avanzare la nostra comprensione della formazione di metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.

Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno

Qui, presentiamo un protocollo per indurre e segnare la malattia in un modello di malattia xenogeneica innesto contro ospite (xenoGVHD). xenoGVHD fornisce un modello in vivo per studiare l'immunosoppressione delle cellule T umane. Inoltre, descriviamo come rilevare le cellule T umane nei tessuti con la PCR digitale come strumento per quantificare l'immunosoppressione.

Induzione e punteggio della malattia di Graft-Versus-Host in un modello di Murine Xenogeneico e quantificazione delle cellule T umane nei tessuti del topo utilizzando pcR digitale

Descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello murino xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale. Questo protocollo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire e caratterizzare modelli simili per la valutazione della terapia I-O.

Un ormone e mezzo umano (PBMC) Un modello di Xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale (I-O)

La malattia da innesto contro ospite è una complicazione importante dopo il trapianto di midollo osseo allogenico. Le cellule dendritiche svolgono un ruolo critico nella patogenesi della malattia da trapianto contro ospite. L'articolo attuale descrive una nuova piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nello sviluppo della malattia da trapianto contro ospite e l'effetto innesto contro leucemia.

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

Presentato è un protocollo per l'espansione del prodotto farmaceutico a cellule T Gamma-Delta (γδ). I linfociti sono isolati per elutriazione e arricchiti con acido zoledronico e interleuchina-2. Le cellule T alfa-beta vengono esaurite utilizzando un dispositivo di separazione magnetica di grado clinico. Le cellule γδ sono co-coltivate con cellule derivate da K562, che presentano antigeni artificiali ed espanse.

Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Gli osteoclasti sono cellule chiave che riassorbono le ossa nel corpo. Questo protocollo descrive un metodo affidabile per la differenziazione in vitro degli osteoclasti dai monociti del sangue periferico umano. Questo metodo può essere utilizzato come uno strumento importante per comprendere ulteriormente la biologia degli osteoclasti nell'omeostasi e nelle malattie.

Differenziazione degli osteoclasti funzionali dai monociti CD14+ del sangue periferico umano

Qui, abbiamo stabilito osteo-organoidi in vivo innescati da scaffold di gelatina caricati con proteina morfogenetica ossea 2 per raccogliere cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche per la ricostruzione di un sistema ematopoietico e immunitario danneggiato. Nel complesso, questo approccio può fornire una promettente fonte cellulare per le terapie cellulari.

Approccio osteo-organoide in vivo per la raccolta di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche

Qui si descrive un metodo per l'attivazione ed espandere cellule NKT dal bulk popolazioni di cellule T usando cellule presentanti antigene artificiali (AAPC). L'uso di CD1d basata AAPC fornisce un metodo standard per la generazione di numeri elevati di cellule NKT funzionali.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Scopri l'espansione su larga scala di cellule T γδ dal sangue periferico umano utilizzando zoledronato e IL-2. Questo metodo supporta l'immunoterapia cellulare autologa nel trattamento del cancro.

Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

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