Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione
19 novembre 2011
La tecnica di dissezione illustra enucleazione dell'occhio mouse per il fissaggio del tessuto per eseguire fenotipizzazione in alto throughput schermi.
In questo video verrà illustrato l'occhio del topo e la nucleazione, ovvero la rimozione del bulbo oculare dalla cavità orbitaria. Il bulbo oculare è delimitato dal margine della palpebra inferiore. Questa è la commessura mediale o nasale.
Sul retro si trova il canto temporale o laterale. Sopra c'è il margine della palpebra superiore. Ecco un campione chirurgico.
L'ago è puntato sulla cornea trasparente. Possiamo vedere una piccola parte del cristallino che sporge oltre l'iride. L'iride è qui in marrone, a coprire il cristallino.
Il punto di riferimento chirurgico più importante è questa linea bianca, o il limbo, dove verrà effettuata una ferita da punta appena al di dietro. La metà posteriore del bulbo oculare si trova al di là del limbo e stiamo indicando un'inserzione muscolare. È possibile osservare il muscolo adagiato contro il bulbo qui, e quindi il tessuto connettivo che riempie l'orbita e comprende la ghiandola di Arian.
E infine, questa è la lunga striscia bianca del nervo ottico ottenuta da una dissezione non affilata. Utilizzando una pinza curva per medicazioni, modificata con una punta affilata, iniziare separando le palpebre. Questo tende a far sporgere l'occhio in avanti e verso l'esterno.
Usare con attenzione la pinzetta per accedere all'orbita e posizionarla dietro il bulbo oculare, comprimerla delicatamente nella zona retrobulbare senza schiacciare il bulbo stesso e tirare in avanti. Si dovrebbe essere in grado di afferrare il tessuto connettivo e non il bulbo oculare. Se si ruota il bulbo oculare verso il lato, è possibile osservare il tessuto orbitario insieme al nervo ottico bianco.
Questa è una seconda dissezione, utile a mostrare nuovamente come si entri dal canthus, si spingano le pinzette dietro il bulbo oculare, si afferrino i tessuti connettivi e li si tiri in avanti senza esercitare pressione diretta sul bulbo oculare stesso. Ancora una volta, è possibile osservare il tessuto connettivo nella lunga striscia bianca del nervo ottico. Per creare una ferita da punta, afferrare il bulbo oculare tramite un'inserzione muscolare e inserire un ago dietro il limbus, proprio accanto al punto in cui si tiene l'occhio per stabilizzarlo.
Questo permetterà al fissativo di entrare nell'occhio. Se si pratica la puntura lontano dal punto in cui si tiene l'occhio, il bulbo oculare sarà molto instabile e sarà difficile praticare la ferita, a meno che non si comprima l'occhio o si eserciti una pressione eccessiva. È inoltre possibile afferrare tutto il tessuto connettivo subito dietro il bulbo oculare.
Alcuni fissativi non richiedono una ferita da punta. In generale, poniamo l'occhio in un vial di scintillazione da cinque cc con almeno tre cc di fissativo per assicurarci che l'occhio sia completamente immerso. Per animali fissati mediante perfusione, è necessaria una dissezione accurata.
Utilizziamo una pinzetta curva Calibri e forbici Wescott curve. Afferrare la palpebra inferiore con la pinzetta Calibri. Inserire le forbici contro l'osso orbitale e iniziare a tagliare il tessuto connettivo.
Utilizziamo la curvatura lontana dal bulbo oculare ed evitiamo il dimensionamento. Qualsiasi parte dell'occhio funzionerà lungo tutto il margine della palpebra inferiore, da un canthus all'altro. In un determinato punto, la maggior parte del tessuto connettivo verrà rimossa e sarà possibile far scivolare le forbici dietro il bulbo oculare e tirarlo via.
Ecco un altro esempio, in cui le forbici vengono inserite nell'orbita, ma contro l'osso orbitario piuttosto che contro il bulbo oculare, tagliando i tessuti connettivi. Questo inizierà a liberare il bulbo oculare, simile a una palla da basket in un canestro. Utilizzare la pinzetta per retrarre le palpebre e praticare piccoli tagli delicati intorno al bulbo oculare.
Qui afferramo il tessuto connettivo o un'inserzione muscolare con il Collibra e completiamo il distacco del bulbo oculare dal tessuto connettivo orbitale. Dopo che i bulbi oculari sono stati adeguatamente fissati e, se necessario trasportarli, poniamo della pellicola parafilm intorno al vial di stoccaggio.
L'imballaggio deve essere conforme alle normative della vostra università e del governo. Di solito poniamo questi in un contenitore con un po' di cotone per raccogliere eventuali liquidi; questo contenitore deve essere sigillato molto bene. Questo contenitore per la spedizione viene quindi inserito in un sacchetto di plastica protettiva con bolle.
Questo viene inserito in un imballaggio per spedizione di liquidi in laboratorio, insieme a qualsiasi documentazione.
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Panoramica
Questo video illustra la tecnica di enucleazione dell'occhio del topo, fondamentale per la fissazione del tessuto in schermate fenotipiche ad alto rendimento. La procedura prevede la rimozione del bulbo oculare dalla sua orbita, evidenziando i punti di riferimento anatomici per maggiore chiarezza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
Sfondo
- L'enucleazione è una tecnica fondamentale in vari studi biologici.
- La comprensione dell'anatomia dell'occhio facilita interventi chirurgici precisi.
- Questo metodo è essenziale per applicazioni di screening ad alto rendimento.
- Una corretta fissazione dei tessuti è necessaria per un fenotipaggio accurato.
Scopo dello studio
- Dimostrare la tecnica di enucleazione a scopo educativo.
- Fornire una guida visiva ai ricercatori che eseguono procedure simili.
- Migliorare la comprensione dei punti di riferimento anatomici durante l'intervento chirurgico.
Metodi Utilizzati
- Dimostrazione video del processo di enucleazione.
- Identificazione delle caratteristiche anatomiche principali dell'occhio del topo.
- Guida passo dopo passo per l'esecuzione della procedura.
- Strumenti visivi per supportare l'apprendimento e l'applicazione.
Risultati principali
- Chiara visualizzazione della tecnica di enucleazione.
- Identificazione del canthus mediale e laterale.
- Dimostrazione del reperto chirurgico post-enucleazione.
- Migliore comprensione della procedura per schermate ad alto rendimento.
Conclusioni
- Il video rappresenta uno strumento educativo efficace per i ricercatori.
- Comprendere il processo di enucleazione è fondamentale per una fissazione dei tessuti efficace.
- Una tecnica corretta può migliorare i risultati negli studi di fenotipizzazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La fenotipizzazione a distanza ad alto rendimento degli occhi di topo consente l'utilizzo distribuito delle risorse genetiche e accelera la scoperta di correlazioni genotipo-fenotipo nei modelli di malattie oftalmiche. Protocolli standardizzati di enucleazione e trasferimento dei tessuti riducono le barriere geografiche e operative, sostenendo ricerche precliniche scalabili e multisede. Questo approccio migliora l'accesso su scala dell'intero portafoglio a linee transgeniche rare o geograficamente diffuse per la validazione precoce di bersagli e lo screening fenotipico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Permette la raccolta sistematica di tessuti oculari da diversi background genetici per studi basati su ipotesi.
- Consente la validazione funzionale di geni candidati implicati nello sviluppo oculare e nelle malattie oculari.
- Supporta una previsione affidabile nell'associare perturbazioni genetiche a esiti fenotipici.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce campioni di tessuto fissati standardizzati, adatti per saggi molecolari e morfologici successivi.
- Migliora la riproducibilità e il confronto tra schermate fenotipiche condotte in più sedi.
- Permette la preparazione scalabile di campioni per piattaforme di screening ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la fenotipizzazione del topo alla scoperta di biomarcatori traslazionali per le malattie oftalmiche umane.
- Supporta la continuità dalla scoperta genetica alla validazione preclinica dei meccanismi della malattia.
- Riduce gli ostacoli logistici all'accesso a modelli murini rari o distribuiti geograficamente.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di enucleazione remota e trasferimento dei tessuti si inserisce nel percorso iniziale della scoperta e nella fase preclinica, collegando la generazione di modelli genetici con la fenotipizzazione e l'analisi centralizzate.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio meccanicistico fornendo accesso a modelli genetici diversificati.
- Screening: Standardizza la preparazione dei campioni per saggi di fenotipizzazione quantitativi e riproducibili.
- Analisi: Supporta l'acquisizione di parametri morfologici e molecolari per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei fenotipi murini con i biomarcatori delle malattie umane.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per l'acquisizione distribuita di tessuti all'interno di reti di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle associazioni genotipo-fenotipo e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Razionalizza la logistica, standardizza le procedure e consente la scalabilità su più siti.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento/cessazione ampliando l'accesso ai dati fenotipici provenienti da modelli rari.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei target genetici e dei modelli di malattia adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze chirurgiche nell’enucleazione oculare del topo e nella manipolazione dei tessuti.
- Necessita dell’accesso a reagenti per la fissazione, contenitori per spedizioni validati e conformità alle normative per il trasporto.
- Richiede standardizzazione condivisa tra diversi siti per le procedure di raccolta e documentazione.
- Adattabile a flussi di lavoro con tessuti non fissati e fissati mediante perfusione, come supportato dal protocollo.
- È subordinato alle linee guida istituzionali e governative per il trasporto di campioni biologici.
