Imaging del rilascio di neurotrasmettitori utilizzando reporter ingegnerizzati fluorescenti con neurotrasmettitore basato su cellule

Prendi un mouse con una finestra cranica contenente un sottile strato di cranio per consentire la visualizzazione del cervello.

Il movimento della testa è limitato utilizzando una barra di testa collegata.

La corteccia è pre-iniettata con neurotrasmettitori cellulari fluorescenti ingegnerizzati reporter, o CNiFER, che sono cellule reporter che consentono il rilevamento in tempo reale del rilascio di neurotrasmettitori.

I CNiFER esprimono un recettore del neurotrasmettitore accoppiato a proteine G e un rivelatore citoplasmatico di calcio, che consiste in un dominio legante il calcio fuso ai fluorofori donatori e accettori.

Utilizzando un microscopio a due fotoni, eccitare il rivelatore per causare l'emissione di fluorescenza del donatore e abilitare la visualizzazione CNiFER.

L'attività neuronale che raggiunge la corteccia provoca il rilascio di neurotrasmettitori.

Questi neurotrasmettitori si legano ai recettori CNiFER e attivano vie di segnalazione che inducono il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico.

L'aumento del calcio citoplasmatico si lega al rivelatore, provocando un cambiamento conformazionale che porta i fluorofori in prossimità.

Il donatore trasferisce energia all'accettore per stimolare l'emissione di fluorescenza dell'accettore, indicando il rilascio di neurotrasmettitori.

Posizionare la piattaforma di imaging con il mouse trattenuto sotto un obiettivo a immersione in acqua 10x in un microscopio per immagini a due fotoni. Inserire il cubo filtrante per l'imaging FRET che ha uno specchio dicroico a 505 nanometri e filtri passa-banda che vanno da 460 nanometri a 500 nanometri per misurare ECFP e da 520 nanometri a 560 nanometri per misurare Citron.

Quindi aggiungere l'ACSF al pozzetto, contenente la finestra del cranio assottigliata, e abbassare l'obiettivo di immersione in acqua 10x nell'ACSF. Utilizzare l'oculare, in combinazione con la lampada al mercurio e il cubo del filtro GFP, per localizzare i cNIFER. Ora passa all'obiettivo a immersione in acqua 40x.

Quindi, selezionare il percorso della luce appropriato per l'imaging a due fotoni. Accendi il laser pulsato a femtosecondi nel vicino infrarosso. Selezionare la lunghezza d'onda di 820 nanometri e un'impostazione di potenza dal 5 al 15%. Impostare la tensione PMT1 e PMT2 su un valore submassimale, in genere da 500 a 1000 volt, a seconda del PMT.

Quindi impostare il guadagno a 1 per ogni canale e 0 la posizione Z per l'obiettivo. Abbassare l'obiettivo di circa 100-200 micrometri dalla superficie corticale e avviare la scansione x, y. Regolare il guadagno di potenza del laser e la tensione PMT per ciascun canale per ottimizzare il rapporto segnale/rumore della fluorescenza dei cNIFER.

Quindi, utilizzare il software per limitare l'imaging a una regione che contiene le cellule cNIFER e una regione di sfondo. Selezionare la media della linea di Kalman per due per un rapporto segnale/rumore adeguato e utilizzare una velocità di scansione da 0,3 a 1 hertz a 4 microsecondi per pixel. Dopodiché, disegna un ROI attorno alle celle cNIFER, circondando circa tre o quattro celle per piano.

Imposta l'analisi in tempo reale delle intensità medie del ROI. Quindi avviare l'acquisizione per monitorare la fluorescenza del cNIFER nel tempo e iniziare la stimolazione elettrica o un esperimento comportamentale durante il monitoraggio del fret.