Isolamento e purificazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche ricombinanti

0 visualizzazioni3:59 min • August 7th, 2025

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MOGtag è una glicoproteina oligodendrocitaria mielinica ricombinante fusa con tag di solubilizzazione e purificazione per studi sperimentali di encefalomielite autoimmune.

Per isolare MOGtag, sospendere le cellule batteriche che esprimono MOGtag in un tampone di lisi e incubare.

Gli enzimi e i detergenti nel tampone distruggono i lipidi di membrana e degradano la parete cellulare.

Sonicare per lisare ulteriormente le cellule, rilasciando corpi di inclusione insolubili contenenti MOGtag.

Centrifuga per pellettare i corpi di inclusione. Scartare il surnatante, risospendere il pellet nel tampone e incubare.

Aggiungere la guanidina cloridrato, quindi incubare per solubilizzare il MOGtag.

Trasferire le proteine solubili su una resina di nichel carica, mescolare e incubare agitando per consentire a MOGtag di legarsi agli ioni di nichel.

Centrifuga per pellettare il MOGtag legato. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in un tampone di eluizione e incubare agitandolo.

L'imidazolo nel tampone di eluizione rilascia MOGtag dalla resina.

Centrifugare di nuovo, raccogliere il surnatante purificato contenente MOGtag e conservarlo per ulteriori analisi.

Distribuire le colture in modo uniforme su bottiglie da 250 millilitri compatibili con la centrifugazione ad alta velocità e mantenere le bottiglie in ghiaccio da questo punto in poi. Pellettare le cellule batteriche a 22.000 * g per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Risospendere e combinare tutti i pellet batterici in un totale di 30 millilitri di tampone di lisi. Trasferire questo volume in una provetta da 50 millilitri a fondo tondo in grado di eseguire una centrifugazione ad alta velocità.

Metti questo tubo in un bagnomaria a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Durante il tempo di incubazione, agitare la provetta due volte per risospendere le cellule. Dopo l'incubazione, trasferire il tubo sul ghiaccio e sonicare la soluzione a 20 kilohertz e ampiezza del 70%, pulsando per tre secondi e spegnendo per tre secondi per 5 impulsi. Sonicare la soluzione per sei cicli totali di cinque impulsi, lasciando che la soluzione si raffreddi sul ghiaccio tra un giro e l'altro.

Successivamente, centrifugare la soluzione a 24.000 * g per 15 minuti a 4 gradi Celsius, quindi risospendere il pellet in 30 millilitri di tampone A e incubare la soluzione a 4 gradi Celsius per tre ore. Quindi, aggiungere 17,2 grammi di guanidina-HCl alla soluzione. Incubare il campione su ghiaccio per un'ora per solubilizzare la proteina tag MOG. Per purificare la proteina tag MOG, trasferire l'intero volume di proteina solubilizzata nella prima provetta contenente resina di nichel. Dopo la miscelazione, posizionare il tubo orizzontalmente su un bilanciere a 4 gradi Celsius per un'ora.

Dopo aver centrifugato la provetta a 4.500 * g per otto minuti a 4 gradi Celsius, trasferire il surnatante nella seconda provetta di resina di nichel e incubare come prima. Nel frattempo, risospendere la resina di nichel nella prima provetta in 40 millilitri di tampone di eluizione e posizionare la provetta orizzontalmente su un bilanciere a 4 gradi Celsius per cinque minuti prima di centrifugare come prima. Trasferire il surnatante contenente la proteina tag MOG eluita in un flacone da 250 millilitri etichettato con proteina tag MOG purificata. Conservare questa bottiglia a 4 gradi Celsius.

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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026