Iperinsulinemico-euglicemico Morsetti in Cosciente, Mouse sfrenato

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'azione dell'insulina a livello sistemico e specifico per tessuto in topi coscienti e non stressati, senza manipolarli. Questo risultato si ottiene impiantando chirurgicamente un catetere nella vena giugulare per le infusioni e un altro nell'arteria carotidea per prelevare campioni ematici. Dopo un periodo di recupero della durata di cinque a sette giorni, i topi sottoposti a digiuno per cinque ore vengono infusi con insulina per raggiungere un'iperinsulinemia fisiologica.

I livelli di glucosio vengono quindi misurati tramite il catetere arterioso e la glicemia U viene mantenuta regolando la velocità di infusione del glucosio. Questo esperimento consente di misurare le differenze nella sensibilità all'insulina a livello dell'intero organismo, basandosi sulla relazione diretta tra la velocità di infusione del glucosio necessaria per mantenere la glicemia U e l'azione insulinica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per il prelievo di sangue, come il taglio della coda, è che il catetere arterioso impiantato chirurgicamente fornisce un accesso vascolare al topo, permettendo di ottenere campioni ematici senza dover manipolare l'animale.

Questo ci permette di eseguire questi esperimenti con topi non stressati e non vincolati. Il catetere arterioso viene realizzato inserendo un pezzo di tubo PE 10 con estremità smussata in un pezzo di tubo astic lungo sei centimetri, in modo che il PE 10 sporga di 0,9 centimetri rispetto al SEL. Il catetere venoso è costituito da un pezzo di tubo SEL lungo sei centimetri con collare.

La masa viene costruita inserendo pezzi di PE 20 lunghi tre centimetri in ciascuno dei due connettori in acciaio inossidabile da 1,3 centimetri a 25 gauge, Ben, formando un angolo di circa 120 gradi. Questi vengono inseriti in una piccola quantità di adesivo medico in silicone come mostrato qui. Per iniziare l'implantazione del catetere, posizionare un topo anestetizzato su una superficie di lavoro pulita utilizzando una tecnica sterile. Praticare un'incisione di cinque millimetri a destra della linea mediana.

Isolare la vena giugulare destra. Legare con cura la vena cefalica, terminando con una sutura in seta, e praticare un legamento lasso con un altro pezzo di sutura all'estremità caudale. Successivamente, tagliare appena al di sotto della legatura della cefalica con forbici a molla ed inserire il catetere fino al punto di arresto.

Legare un filo di sutura dietro la perlina e verificare il funzionamento del catetere collegando l'estremità libera del catetere a una siringa di campionamento. Per posizionare il catetere arterioso, praticare un'incisione di piccole dimensioni, cinque millimetri a sinistra dello sterno e in posizione cefalica rispetto alla prima incisione. Isolare l'arteria carotidea sinistra, quindi legare la porzione cefalica.

Terminare con sutura di seta e fare un nodo lento. Un altro pezzo di sutura sull'estremità causale del vaso esposto. Successivamente applicare una pinza sull'estremità codale del vaso.

Tagliare appena al di sotto dell'estremità legata con forbici a molla. Inserire con attenzione il catetere fino alla pinza. Rilasciare con cura la pinza e avanzare il catetere fino alla giunzione Astic P.

Fissare saldamente le legature al catetere e verificare il corretto posizionamento del catetere collegando l'estremità libera a una siringa di campionamento. Successivamente, girare l'animale e praticare un piccolo taglio tra le scapole, quindi creare un tunnel sottocutaneo utilizzando un ago da 14 gauge, partendo dai tagli anteriori fino a raggiungere il taglio posteriore. Far passare i cateteri attraverso l'ago per esteriorizzarli sulla parte dorsale del topo.

Collegare i cateteri arteriosi e venosi ai connettori appropriati sull'antenna del mouse per l'accesso al campionamento o al masa. Successivamente, inserire il masa nell'incisione tra le scapole. Chiudere entrambe le incisioni con sutura in nylon.

Verificare la pervietà di entrambi i cateteri. Posizionare il topo in una gabbia calda e pulita per il recupero e permettere al topo di riprendersi per almeno cinque giorni prima del clamp insulinico. Il passaggio più difficile nell'esecuzione di un clamp iperinsulinemico euglicemico nei topi consiste nel tentativo di mantenere l'euglicemia.

I topi hanno un metabolismo molto rapido e i loro livelli di glucosio possono variare notevolmente durante l'esperimento. Ciò richiede una certa pratica per acquisire familiarità con l'andamento dei livelli glicemici nei topi nel corso di un esperimento e per imparare a regolare di conseguenza la velocità di infusione del glucosio al fine di mantenere una glicemia costante. Qui è mostrata la configurazione per un clamp standard.

Tre linee di infusione, contenenti rispettivamente glucosio, insulina ed eritrociti lavati, sono collegate a un connettore a quattro vie fissato a un giunto rotante sospeso sopra il topo. Il collegamento di infusione del giunto rotante è connesso al catetere venoso. Prima di collegare il topo, riempire tutte le linee delle infusione con soluzione fisiologica.

Successivamente, riempire la linea di campionamento con soluzione salina eparinizzata. Lasciare una siringa contenente soluzione salina eparinizzata collegata alla sommità del connettore rotante, insieme alla siringa per la pulizia. Iniziare il digiuno dei topi cinque o sei ore prima dell'inizio della procedura di clampaggio.

Tre ore dopo l'inizio del digiuno, pesare il topo e collegare rispettivamente i cateteri venoso e arterioso alle linee di infusione e campionamento. Quindici minuti prima dell'inizio della clamp, inserire una flebo di glucosio vuota in un glucometro portatile. Successivamente, aspirare circa 50 microlitri di sangue nella siringa di spurgo per rimuovere qualsiasi soluzione salina dalla linea e staccare la siringa di spurgo.

Misurare il livello di glucosio nel sangue toccando la striscia reattiva con la goccia di sangue che si forma all'estremità del tubo. Successivamente, inserire una siringa con ago smussato nella linea di campionamento ed aspirare 50 microlitri di sangue. Versare il sangue in un tubo rivestito con EDTA e centrifugare il tubo per raccogliere il plasma destinato alle misurazioni degli ormoni e dei metaboliti basali.

A questo punto, reinserire la siringa di spurgo e aspirare lo stantuffo. Per rimuovere le bolle d'aria, reinfondere i 50 microlitri di sangue inizialmente prelevati. Registrare il valore di glicemia riportato dal glucometro.

Dieci minuti dopo, utilizzare il glucometro e la siringa di spurgo per ripetere la misurazione della glicemia, quindi prelevare altri 50 microlitri di sangue per ottenere un ulteriore campione di plasma. Dopo aver effettuato le seconde misurazioni di base, riempire le linee di infusione per glucosio, insulina e eritrociti lavati con soluzione salina fino al connettore a quattro vie. Collegare il connettore a quattro vie al tubo collegato al porto di infusione con swivel.

Iniziare infondendo gli eritrociti lavati con soluzione fisiologica. Impostare la velocità di infusione in modo da sostituire il volume totale di sangue prelevato durante tutta la durata dello studio. Una volta che l'infusione di eritrociti raggiunge il topo, iniziare le infusioni di insulina e glucosio.

Questo è il tempo pari a zero minuti. L'insulina viene infusa a un tasso costante predeterminato. Il tasso iniziale di infusione di glucosio viene stimato in base ai livelli di glucosio nel sangue basali e all'esperienza precedente.

Nel corso delle due ore successive, effettuare letture della glicemia con il glucometro e regolare la velocità di infusione di glucosio per mantenere la glicemia target. Registrare i nuovi valori di glicemia e le velocità di infusione di glucosio ogni 10 minuti, e a 100 e 120 minuti raccogliere ulteriore sangue per la misurazione dell'insulina plasmatica e di altri ormoni o metaboliti. Qui viene mostrato l'andamento dei livelli di glucosio durante tutta la procedura di clamp, che dimostra quanto bene la glicemia sia stata mantenuta sia nei topi alimentati con dieta standard sia in quelli con dieta ricca di grassi. L'andamento della velocità di infusione di glucosio mostra che la velocità necessaria per mantenere la glicemia è significativamente più bassa nel gruppo alimentato con dieta ricca di grassi, indicando un'alterazione dell'azione insulinica a livello dell'organismo.

Sia i livelli di insulina a digiuno sia quelli durante il clamp sono anche più elevati nel gruppo alimentato con dieta ricca di grassi, ulteriore conferma della presenza di un fenotipo resistente all'insulina. In questi topi, il glucosio triziato viene utilizzato per stimare la velocità di comparsa endogena del glucosio. Endo a è un indice della produzione epatica di glucosio, mentre l'insulina sopprime completamente endo A nei topi di controllo.

La soppressione è compromessa nei topi alimentati con una dieta ricca di grassi. Analogamente, il glucosio TRID viene utilizzato per stimare la velocità di scomparsa del glucosio a livello dell'intero organismo. Rd la capacità dell'insulina di stimolare RD è compromessa nei topi alimentati con una dieta ricca di grassi.

Due deossiglucosio contenenti carbonio 14 vengono utilizzati per valutare l'indice metabolico del glucosio RG, una misura dell'assorbimento specifico del glucosio da parte dei tessuti. Come mostrato in questo esempio, l'assorbimento stimolato dall'insulina del glucosio nel muscolo scheletrico risulta compromesso nei topi alimentati con una dieta ricca di grassi. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontrano difficoltà nella microchirurgia necessaria per impiantare i cateteri arteriosi e venosi.

L'intervento chirurgico richiede competenze altamente specializzate ed è necessario esercitarsi costantemente per diversi mesi prima di raggiungere una notevole abilità nell'esecuzione dell'intervento per il clamp iperinsulinemico euglicemico; la difficoltà, ancora una volta, consiste nel tentativo di mantenere l'euglicemia in un modello animale con un metabolismo molto elevato.