Imaging della dinamica subcellulare del calcio nei neuroni di Caenorhabditis elegans

Prendi due ceppi transgenici separati di Caenorhabditis elegans su vetrini con cuscinetti di agar. I cuscinetti contengono una soluzione di rotolamento con un agente paralitico che riduce al minimo il movimento.

Il cordone nervoso ventrale dei vermi, o VNC, contiene interneuroni eccitatori che esprimono indicatori citoplasmatici di calcio in un ceppo e indicatori di calcio mitocondriali nell'altro.

Posiziona un vetrino coprioggetti per far rotolare i vermi, orientando il VNC per la visualizzazione, quindi posizionali sotto un microscopio a fluorescenza.

Usa la luce visibile per localizzare i vermi, quindi passa alla modalità a fluorescenza.

Nei neuroni a riposo, un basso livello di calcio intracellulare mantiene gli indicatori non legati, con conseguente debole fluorescenza.

L'attività neuronale spontanea apre i canali del calcio voltaggio-dipendenti, consentendo l'afflusso di calcio.

Nel ceppo con indicatori citoplasmatici, il calcio si lega agli indicatori, migliorando la fluorescenza citoplasmatica.

L'eccesso di calcio citoplasmatico entra nei mitocondri attraverso i canali. Nel ceppo con indicatori mitocondriali, il legame con il calcio aumenta la fluorescenza mitocondriale.

Visualizzare i neuroni in entrambi i ceppi per monitorare la dinamica subcellulare del calcio.

In una provetta di coltura di vetro da 13 x 100 millimetri, preparare 3 millilitri di agar al 10% sciogliendo l'agar di grado molecolare in M9 e cuocendolo nel microonde per alcuni secondi. Per realizzare i tamponi di agar, preparare prima due vetrini aggiungendo due strati di nastro da laboratorio. Quindi posizionare un vetrino da microscopio tra i due vetrini. Tagliare la punta di un puntale per pipetta da 1.000 microlitri e utilizzarla per pipettare una piccola goccia di agar al centro del vetrino coprioggetti.

Appiattisci l'agar premendo un altro vetrino verso il basso sopra l'agar. Dopo il raffreddamento, tagliare l'agar in un piccolo disco utilizzando l'apertura di un tubo da 10 millilitri e poi rimuovere l'agar circostante. Quindi, preparare la soluzione di rotolamento della vite senza fine sciogliendo la polvere di muscimolo in M9 per creare un brodo da 30 millimolari. Diluire il materiale in un rapporto uno a uno con perline di polistirene per ottenere la soluzione di rotolamento.

Per posizionare il verme per l'imaging, posizionare prima 1,6 microlitri di soluzione di rotolamento al centro del tampone di agar. Quindi, utilizzando un plettro a vite senza fine preferito, trasferire un verme dell'età desiderata nella soluzione di rotolamento sul tampone di agar. Attendere circa cinque minuti affinché il muscimolo riduca il movimento del verme, quindi far cadere un vetrino coprioggetti di 22 x 22 millimetri sopra il tampone di agar.

Per l'imaging dei neuriti nel midollo nervoso ventrale, arrotolare il verme facendo scorrere leggermente il vetrino coprioggetti. Per montare il verme sul microscopio, posizionare una goccia di olio da immersione sul vetrino coprioggetti. Trova il verme usando un obiettivo a basso ingrandimento in campo chiaro. Quindi passa all'obiettivo 100X e individua il neurite AVA utilizzando l'illuminazione del GCaMP o del mito-GCaMP con il laser di imaging a 488 nanometri.