Name: Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Impara la purificazione di Hsp104, una disaggregasi proteica esamerica AAA+ del lievito, mediante cromatografia di affinità, scambio anionico e filtrazione su gel. Questo protocollo garantisce elevate rese di proteina attiva per studi strutturali e funzionali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del NIH (5T32GM008275-22) e un americano comunione Heart Association predoctoral (a EAS), una Chimica-Biologia Fellowship interfaccia dal NIH (2T32GM071339-06A1) (MED); e sovvenzioni da parte NIH (1DP2OD002177-01 e NS067354-0110), Il Ellison Medical Foundation e la Fondazione Bill e Melinda Gates Foundation (per JS).

1. Espressione di Hsp104 <ol><li> Il plasmide utilizzato per la purificazione in E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, contiene la Hsp104 open-lettura telaio sotto il controllo del promotore inducibile trc 26. Il plasmide produce Hsp104 con un N-terminale suoi 6-tag che possono essere rimossi per scissione della proteasi TEV. Trasforma pPROEX-HTB-Hsp104 in codone ottimizzato E. coli BL21-CodonPlus RIL-cellule (Stratagene, Agilent Technologies) utilizzando una procedura tipica trasformazione batterica (per esempio in base alle istruzioni del produttore). E 'importante utilizzare un codone ottimizzato E. coli ceppo Hsp104 perché ha un pregiudizio insolito codone. </li><li> Inoculare una cultura 2XYT 100 ml (Ricetta USB.: 16g / l di peptone di caseina, 10 g / l estratto di lievito, 5 g / L di NaCl, pH 7,0) integrato con 100μg/mL ampicillina e cloramfenicolo 34μg/mL con trasformanti fresca e crescere overnight a 37 ° C con agitazione a 200gpm. </li><li> Inoculare 10 mL della cultura durante la notte in 6 X 1L 2XYT con 100μg/mL 34μg/mL ampicillina e cloramfenicolo in fiaschi 2L. Agitare a 250rpm a 37 ° C fino OD 600 = ,4-0,6. A smettere di tremare e ridurre la temperatura a 15 ° C. Consentono alle cellule di equilibrare unagitated per 30min nell'incubatrice fino a raggiungere 15 ° C. Una volta a 15 ° C viene raggiunta indurre l'espressione delle proteine ​​con l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mm. Riprendi agitazione a 250rpm notte (12-16 ore). </li></ol> 2. Raccolta e lisi delle cellule <ol><li> Harvest cellule mediante centrifugazione (in un rotore preraffreddato) a 4.000 rpm per 20min a 4 ° C (usiamo un Sorvall RC 3BP centrifuga +). I passi successivi devono essere eseguiti immediatamente, perché Hsp104 attività è diminuito quando E. coli sono congelati. Inoltre, tutti i passi successivi devono essere eseguiti su ghiaccio o a 4 ° C. </li><li> Pellet cellulari risospendere in prechilled (su ghiaccio) 10 ml tampone di lisi (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 500mm KCl, 20 mM MgCl 2, 2.5% (w / v) glicerolo, 20 mM imidazolo, 5 micron pepstatina A, completo cocktail inibitore della proteasi (1 EDTA senza tablet/50mL), e 2mM β-mercaptoetanolo). </li><li> Lisare le cellule con una stampa francese (Emulsiflex) omogeneizzatore che utilizza uno scambiatore di calore immerso in acqua ghiacciata. Prima dell'uso, assicurarsi che tutti i grumi di cellule sono state solubilizzate. Dopo equilibrante omogeneizzatore con tampone di lisi, due passa attraverso il cilindro con una pressione di 15.000-18.000 psi è sufficiente per lisi completa. Se una stampa francese non è disponibile, l'incubazione con lisozima seguita da sonicazione può essere utilizzato (vedi discussione). Salva un piccolo campione di cellule lisate per l'analisi SDS-PAGE (1ml) (lisato in fig. 2). </li><li> Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 16.000 rpm per 20min a 4 ° C (usiamo un RC5C Sorvall centifuge +). Conservare il supernatante per la fase successiva e salvare un piccolo campione (1ml) di supernatante per SDS-PAGE analisi (Load Ni in fig. 2). </li></ol> 3. Hsp104 Purificazione <ol><li> Mix surnatante dal punto 2.4 con 12mL (2 ml Ni-Sepharose perle per 1L di cellule) del 50% impasto di buffer di lisi equilibrata Ni-Sepharose perline (GE). </li><li> Ruotare il campione lentamente per 3 ore a 4 ° C in modo tale che Ni-Sepharose rimane fluttuante e schiumare è ridotto al minimo. Tempi di incubazione più brevi sono possibili, ma diminuisce la resa. A 4 ° C in presenza di inibitori della proteasi, il degrado si verifica poco, e un 3 ore al Ni-Sepharose tempo di incubazione non diminuisce l'attività del prodotto finale. Raccogliere Ni-Sepharose tramite centrifugazione per 2 minuti a 4 ° C a 2.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5810R). Salva un piccolo campione di surnatante per SDS-PAGE analisi (1ml) e scartare il resto (flusso Ni Thru (FT) in fig. 2). </li><li> Lavare i recuperate Ni-Sepharose con 25 volumi di colonna di tampone di lavaggio (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20 mM MgCl 2, 2.5% (w / v) glicerolo, 20 mM imidazolo, 2mM β-mercaptoetanolo), 5 volumi di colonna tampone di lavaggio con KCl 1M per rimuovere i contaminanti legato elettrostaticamente a Hsp104, e 25 volumi di colonna di tampone di lavaggio. Raccogliere Ni-Sepharose dopo ogni lavaggio mediante centrifugazione per 2 minuti a 4 ° C a 2.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5810R). Dopo ogni ciclo di lavaggio e centrifugazione, rimuovere tampone per aspirazione. </li><li> Per eluire Hsp104, mescolare Ni-Sepharose con 1 ml di tampone di eluizione (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20 mM MgCl 2, 2.5% (w / v) glicerolo, 350mm imidazolo, 2mM β-mercaptoetanolo) per 1 ml e Ni-Sepharose rotazione a 4 ° C per 20 minuti. L'alta concentrazione imidazolo interrompe il suo tallone-Ni 6 interazione. Rimuovere Ni-Sepharose con colonne vuote 1,2 ml di spin (Bio-Rad) tramite centrifugazione per 2 minuti a 4 ° C a 2.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5810R). Salva 1ml di eluato per SDS-PAGE analisi (eluato Ni in fig. 2). Per ogni litro di cellule, ~ 15 mg di Hsp104 si ottiene in questa fase. </li><li> Buffer eluato scambio in Buffer Q (20 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 0,5 mm, 5mm MgCl 2, 50 mM NaCl) usando MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) 15 ml di unità concentratore centrifugo. In primo luogo, concentrato di proteine ​​di ~ 1,5 ml quindi aggiungere 14.5mL di tampone di Q per diluire proteina di 10 volte. Ripetere 3 volte per lo scambio di buffer. L'aumento del pH e sale a bassa assicura che Hsp104 ha una carica negativa alto. </li><li> Purificare Hsp104 tramite cromatografia a scambio anionico utilizzando un buffer equilibrato Q colonna Risorsa Q 6 ml (GE). Prima dell'iniezione, la proteina viene filtrata attraverso un basso legame proteico Millex GP PES membrana 0.22μM siringa filtro (Millipore). Ci avvaliamo di una portata di 1mL/min. Lavare via debolmente proteine ​​di legame con 1 volume colonna del 20% Buffer Q + (20 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 0,5 mm, 5mm MgCl 2, 1M NaCl). Eluire Hsp104 con sfumatura lineare (20% -50% Buffer Q +) più di 5 volumi di colonna (Fig. 3). Raccogliere frazioni da 1 ml. Hsp104 e la maggior parte delle varianti tipicamente eluire a ~ 400mm NaCl (31mS/cm). Salva campioni delle frazioni di picco (1ml) per SDS-PAGE analisi (Fig. 3, nel riquadro). </li><li> Per rimuovere la sua 6-tag, proteine ​​di scambio con il concentratore centrifugo Amicon come descritto sopra (vedi punto 3.5) nel buffer della scissione (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, KCl 140mm, e 10mM MgCl 2). Usa proTEV proteasi (Promega) o AcTEV proteasi (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Per Hsp104, abbiamo trovato che il più alto rapporto di proteasi TEV: Hsp104 sono necessari per la scissione totale. Usiamo un rapporto di 1 unità di proteasi per 12μg Hsp104. Scissione deve essere eseguita a 30 ° C per 2-4 ore, seguita da una incubazione 16 ore a 4 ° C. Concentrazione finale Hsp104 dovrebbe essere tra 20-75μM monomero. Riducono le rimanenti Hsp104 His6 marcatura ed proteasi TEV con Ni-Sepharose (GE) con l'aggiunta di Ni-Sepharose in eccesso alla quantità di Hsp104 nella reazione della scissione (assumere perle può legare 15 mg di proteina per ml di resina imballato). Rimuovere perline con colonne di rotazione vuoto (Bio-Rad) per centrifugazione per 2 minuti a 2.000 rpm a 4 ° C. Raccogliere i campioni prima e dopo la scissione (1ml) per SDS-PAGE analisi per garantire la scissione, e la rimozione delle proteine ​​uncleaved (Fig. 4). </li><li> Scambio in dimensione del buffer di esclusione (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mm EDTA, 1 mM DTT) utilizzando MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore), come descritto al punto 3.5. </li><li> Ulteriori purificare Hsp104 via dimensione-cromatografia di esclusione. Usa esclusione Superose dimensione del buffer equilibrata 6 o 200 Superdex colonna (sia da GE) (Fig. 5). Prima dell'iniezione, la proteina viene filtrata attraverso un basso legame proteico Millex GP PES membrana 0.22μM siringa filtro (Millipore). Per meno di 10 mg di proteine, le colonne di dimensioni 10/300 (24ml) può essere utilizzato e le frazioni di 0,5 ml sono stati raccolti. Per i campioni maggiori di 10 mg, la colonna dimensione 12/60 (120ml) dovrebbe essere usato e 1 ml frazioni vengono raccolte. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per flussi e volumi di campione da caricare. Dopo la purificazione, frazioni Hsp104 sono riuniti come mostrato in fig. 5 e concentrata in Unità Concentratore Amicon centrifuga (Millipore). Hsp104 viene memorizzato come descritto di seguito. A causa della perdita di materiale a separare Hsp104 prodotti di degradazione e contaminanti la resa finale del purificata full-length Hsp104 è ~ 1-3mg per litro di partenza cultura. </li></ol> 4. Hsp104 Disaggregase attività <ol><li> Dopo la purificazione, è buona per valutare Hsp104 attività in un test di disgregazione. Tipicamente, ci avvaliamo di un saggio di luciferasi riattivazione 2 (Fig. 6). In questo saggio, Hsp104 in collaborazione con il sistema di chaperone Hsp70 (Hsp70 e Hsp40) disaggrega urea-denaturato aggregati luciferasi lucciola 2. Solubile luciferasi catalizza l'ossidazione della luciferina ad oxyluciferin, una reazione che libera la luce. Dalla luminescenza monitoraggio, la riattivazione relativa, e quindi disaggregazione, di luciferasi può essere determinato. Hsp104 deve essere in grado di collaborare in sinergia con il co-chaperone Hsp70 sistema. La quantità di luminescenza recuperato dipende dalla Hsp70 esatta: coppia Hsp40 utilizzati. Noi abitualmente utilizzano Hsp72 e Hsp40 (disegni Assay). Come minimo, attivo Hsp104 dovrebbe produrre un aumento di 5 volte nella riattivazione della luciferasi rispetto alla riattivazione di Hsp72: Hsp40 solo (Fig. 6). Hsp104 preparati che non riescono a raggiungere questo livello di attività vengono scartati. </li></ol> 5. Hsp104 archiviazione <ol><li> Per la conservazione a breve termine, Hsp104 può essere conservato a 4 ° C in formato esclusione buffer. Tuttavia, l'attività si ridurrà dopo 2-3 giorni a 4 ° C e bruscamente dopo 1 settimana a 4 ° C. Per i saggi di disaggregazione si consiglia di Hsp104 deve essere utilizzato il più presto possibile dopo la purificazione. Idealmente, Hsp104 deve essere utilizzato immediatamente per le analisi disaggregazione amiloide. </li><li> Se le proteine ​​devono essere conservati a lungo termine, Hsp104 viene scambiato nella soluzione per la conservazione (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mm EDTA, 1mM DTT, 10% glicerolo (w / v)). Aliquote 100μl sono a scatto congelato in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Cicli di gelo-disgelo ridurre drasticamente Hsp104 attivitàe deve essere evitato. Si consiglia di scongelare lentamente Hsp104 sul ghiaccio. -Amiloide disaggregase attività si ridurrà drasticamente dopo 1 mese a -80 ° C. </li></ol> 6. Risultati Rappresentante e figure: <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Hsp104 è un disaggregase bifunzionali. Disaggregazione degli aggregati disordinati (mostrato a sinistra) richiede la cooperazione del sistema chaperone Hsp70 (Hsp70 e Hsp40) 2. Rimodella Hsp104 ordinato aggregati amiloidi (illustrato a destra) senza l'ausilio di Hsp70 e Hsp40 in vitro, ma Hsp70 e Hsp40 può migliorare Hsp104 attività contro amiloide 26,28. Per entrambe le tipologie di strutture aggregate, Hsp104 coppie idrolisi dell'ATP per traslocazione del substrato attraverso il suo canale centrale per promuovere disaggregazione. Tirosina-cuscinetto loop pori coinvolgere e substrato navetta attraverso il canale centrale 49-52. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. SDS-PAGE analisi di Ni-sefarosio passo affinità purificazione. Lisato, carico Ni, Ni FT e campioni di eluato Ni sono stati frazionati mediante SDS-PAGE utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie . Si noti che non tutti i Hsp104 è in grado di legarsi al Ni-sefarosio. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono mostrati (corsia sinistra). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Risorsa purificazione Q di Ni-sefarosio eluato. Traccia blu rappresenta l'assorbanza a 280 nm e traccia verde rappresenta% Buffer Q + (massimo al 50%). Il primo picco, che eluisce al 20% + Q contiene impurità, prodotti di degradazione e piegato impropriamente Hsp104. Il secondo picco e le principali contiene accuratamente piegati e attiva Hsp104. Portata era 1ml/min. Gradiente che va dal 20-50% Q + è di 30 minuti o 5 volumi di colonna. Riquadro: frazioni di picco vengono risolte mediante SDS-PAGE analisi utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono indicati (a sinistra). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. SDS-PAGE analisi del passo clivaggio della proteasi proTEV. Suoi 6-Hsp104 dalla purificazione delle risorse Q è stato trattato con proteasi proTEV per 4 ore a 30 ° C e poi 16 ore a 4 ° C. I campioni sono stati frazionati mediante la SDS-PAGE utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie. Si noti che proTEV spaccati Hsp104 migra più rapidamente. TEV proteasi e uncleaved Hsp104 sono state esaurite con batterie Ni-Sepharose come descritto al punto 3.7. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono indicati (a sinistra). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Taglia-esclusione di purificazione Hsp104. Spaccati Hsp104 è stato ulteriormente purificato attraverso una colonna 6 gel filtrazione Superose (10/300, GE). = Portata 0.4ml/min. Il picco tra le linee tratteggiate rappresentano frazioni pool. Riquadro: frazioni di picco vengono risolte mediante SDS-PAGE analisi utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono indicati (a sinistra). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Saggio riattivazione luciferasi. Denaturato aggregati lucciola luciferasi (50nm) sono state incubate sia con Hsp72 e Hsp40 (1μM) (entrambi dal design Assay), Hsp104 (6μM monomero) o Hsp104, Hsp72 e Hsp40 per 90min a 25 ° C. Luciferasi denaturato è solo completamente riattivato in presenza di entrambi i Hsp104 e Hsp40/Hsp72. Luminescenza recuperato viene misurato su una piastra lettore Infinite M1000 (Tecan). Valori rappresentano le medie ± SEM (n = 3).

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Timeline: per la massima attività Hsp104 raccomandiamo che il sistema di purificazione intero essere completato il più rapidamente possibile. Tuttavia, il numero di passaggi di purificazione rende un programma impegnativo che non può sempre essere pratico. Se le fasi di purificazione vengono eseguite più rapidamente possibile, il tempo a partire dalla fine di espressione durante la notte fino alle 2-4 ore di incubazione a 30 ° C con proteasi TEV è di circa 9-11 ore. Un posto potenziale per mettere in pausa sta se...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL cellule competenti </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2XYT brodo </td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td> Completi, mini, EDTA senza inibitori della proteasi compresse </td><td> Roche </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> Un pepstatina </td><td> Sigma </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sepharose 6 flusso veloce </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 unità centrifughe filtro (MWCO 30.000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Risorsa Q - colonna 6ml </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEV proteasi </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV proteasi </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose sei 10/300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> Assay Designs </td><td> SPP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Assay Designs </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

purificazione di hsp104, una proteina disaggregase

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 è un esamerica AAA + 1 da proteine ​​del lievito, che le coppie idrolisi dell&#39;ATP alle proteine ​​disaggregazione 2-10 (Fig. 1). Questa attività conferisce due vantaggi chiave selettiva. In primo luogo, rinaturazione di aggregati disordinati di Hsp104 consente la sopravvivenza di lievito, dopo varie sollecitazioni misfolding di proteine, tra cui shock termico 3,5,11,12. In secondo luogo, rimodellamento di cross-beta fibrille amiloidi da Hsp104 lievito permette di sfruttare una miriade di prioni (amiloidi infettive) come un serbatoio di benefici e ereditabile variazione fenotipica 13-22. Sorprendentemente, Hsp104 rimodella direttamente preamyloid oligomeri e fibrille amiloidi, compresi compresi quelli di proteine ​​prioniche il lievito Sup35 e Ure2 23-30. Questo amiloide-rimodellamento funzionalità è un aspetto specializzato di lievito Hsp104. La E. ortologo coli, ClpB, non riesce a oligomeri preamyloid rimodellare o fibrille amiloidi 26,31,32. Ortologhi Hsp104 si trovano in tutti i regni della vita tranne, stranamente, gli animali. Infatti, se le cellule animali possiedono un sistema enzimatico che le proteine ​​coppie disaggregazione di rinaturazione (piuttosto che degrado) rimane sconosciuto 33-35. Così, noi e altri hanno proposto che Hsp104 potrebbe essere sviluppato come agente terapeutico per varie malattie neurodegenerative legate alla misfolding di proteine ​​specifiche in oligomeri preamyloid tossici e fibrille amiloidi 4,7,23,36-38. Non ci sono trattamenti che riguardano direttamente la specie aggregate associati a queste malattie. Eppure, Hsp104 dissolve oligomeri tossici e fibrille amiloidi composto da alfa-sinucleina, che sono collegati con la malattia di Parkinson 23 così come le forme di PrP amiloide 39. Importante, Hsp104 riduce l&#39;aggregazione delle proteine ​​e migliora neurodegenerazione in modelli di roditori della malattia di Parkinson 23 e la malattia di Huntington 38. Idealmente, per ottimizzare la terapia e minimizzare gli effetti collaterali, Hsp104 sarebbe progettato e potenziato per rimodellare selettivamente aggregati specifici centrale per la patologia in questione 4,7. Tuttavia, la limitata comprensione strutturale e meccanicistica di come Hsp104 disaggrega ad un repertorio eterogeneo di strutture aggregate e proteine ​​non correlate frustra questi tentativi 30,40-42. Per comprendere la struttura e il meccanismo di Hsp104, è essenziale per lo studio della proteina pura e ricostituire la sua attività disaggregase con componenti minimi. Hsp104 è una proteina 102kDa con un pI di ~ 5.3, che hexamerizes in presenza di ADP e ATP, oppure a concentrazioni di proteine ​​in assenza di 43-46 nucleotidi. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la purificazione di molto attiva, stabile Hsp104 da E. coli. L&#39;utilizzo di E. coli permette semplificata produzione su larga scala e il nostro metodo può essere eseguita in modo rapido e affidabile per Hsp104 numerose varianti. Il nostro protocollo aumenta Hsp104 purezza e semplifica la sua 6 tag rimozione rispetto ad un metodo di purificazione precedente da E. coli 47. Inoltre, il nostro protocollo è più facile e conveniente di due protocolli più recenti 26,48.

Qui, descriviamo un protocollo per la purificazione del altamente attivi Hsp104, un esamerica AAA + proteine ​​da lievito, che le coppie idrolisi dell&#39;ATP per disaggregazione delle proteine. Questo schema sfrutta un costrutto His6-tag per la purificazione di affinità<em&gt; E. coli</em&gt; Seguita da cromatografia a scambio anionico, His6-tag rimozione di proteasi TEV, e le dimensioni di esclusione cromatografia.

Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

Hsp104 è una proteina AAA+ esamerica del lievito che accoppia l'idrolisi dell'ATP alla disaggregazione proteica2-10 (Fig. 1). Tale attività conferisce due caratteristiche chiave...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre grandi quantità di proteina HSP 1 0 4 A altamente attiva nel deaggregare. Questo risultato si ottiene innanzitutto esprimendo l'HSP 1 0 4 in codice in cellule di e coli ottimizzate. La proteina HS P 1 0 4 viene quindi purificata mediante l'uso di un marcatore di affinità per l'istidina, seguito da una colonna a scambio ionico.Dopo la cromatografia a scambio ionico, il tag di istidina viene rimossa mediante proteasi TEV. L'ultimo passaggio di purificazione consiste nel far passare la proteina HSP 1 0 4 scissa attraverso una colonna di filtrazione su gel.Inoltre, infine, il saggio di riattivazione Elif viene utilizzato per determinare se è stato purificato HSP 1 0 4 attivo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti è costituito sia dal ridotto numero di passaggi sia dall'elevato rendimento di HSP 1 0 4 altamente attivo, adatto a studi strutturali e meccanicistici. I principianti potrebbero incontrare difficoltà poiché la maggior parte dei passaggi di purificazione avviene in un solo giorno, il che comporta un programma intenso.Prima di iniziare questo protocollo, preparare tutti i tamponi necessari per la purificazione di HSP 1 0 4 come descritto nel protocollo scritto allegato a questo video. Inoltre, esprimere la proteina HSP 1 0 4 durante la notte in e coli seguendo la procedura dettagliata nel testo; dopo l'espressione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Ri-sospendere i pellet cellulari in 10 millilitri di tampone di lisi pre-raffreddato prima della lisi cellulare utilizzando un omogeneizzatore a pressione francese, assicurandosi che tutti gli aggregati cellulari siano stati solubilizzati. Dopo aver equilibrato l'omogeneizzatore con il tampone di lisi, lisare le cellule con due passaggi attraverso il cilindro.A una pressione di 15.000-18.000 PS, rimuovo i detriti cellulari mediante centrifugazione e conservo il sopranatante per la successiva purificazione. Iniziare la purificazione della HSP 1 0 4 mescolando il sopranatante con una sospensione al 50% in tampone di lisi di perle di nickel SRO speeds equilibrate. Ruotare il campione lentamente per tre ore a quattro gradi Celsius, in modo che le perle rimangano uniformemente sospese e la formazione di schiuma sia ridotta al minimo.Dopo l'incubazione, raccogliere le sferette di nichel mediante centrifugazione. Lavare le sferette di nichel recuperate con 25 volumi di colonna di tampone di lavaggio. Raccogliere nuovamente le perle mediante centrifugazione, dopo di che il tampone di lavaggio può essere rimosso per aspirazione.Quindi lavare le perle con cinque volumi di colonna di buffer di lavaggio contenente cloruro di potassio uno molare, seguito da 25 volumi di colonna di buffer di lavaggio. Per l'eluizione di HSP 1 0 4, mescolare le perle di nichel con il buffer di eluizione e ruotare a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Separare le perle dall'eluito mediante centrifugazione attraverso colonne vuote da 1,2 millilitro. Ogni litro di cellule produce circa 15 milligrammi di HSB 1 0 4.A questo punto della purificazione, concentrare l’eluito fino a circa 1,5 millilitri utilizzando un concentratore centrifugo con cutoff di peso molecolare 30.000. Quindi aggiungere 14,5 millilitri di tampone Q per diluire la proteina di dieci volte.Ripetere questo processo tre volte per tamponare. Scambiare la proteina prima della purificazione di HSP 1 0 4 mediante cromatografia a scambio anionico. Filtrare la proteina attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri a basso legame proteico.Quindi iniettare la proteina su una colonna da sei millilitri equilibrata con buffer Q. Lavare le proteine legate debolmente con un volume di colonna di 20% di buffer B ed eluire l'HSB 1 0 4 con un gradiente lineare su cinque volumi di colonna, raccogliendo frazioni da un millilitro; l'HSB 1 0 4 e la maggior parte delle sue varianti eluiscono tipicamente a circa 400 millimolari di cloruro di sodio. Per rimuovere il tag esa-istidina, scambiare la proteina utilizzando un concentratore centrifugo ed escindere il tag con la proteasi TEV seguendo le istruzioni del produttore.Eseguire la scissione a 30 gradi Celsius per due-quattro ore, seguita da un'incubazione di 16 ore a quattro gradi Celsius. Rimuovere eventuali residui di HSB 1 0 4 marcati con esa-istidina e la proteasi TEV mediante SRO al nichel, aggiungendo le perle in eccesso rispetto alla quantità di HSP 1 0 4 presente nella reazione di scissione. Successivamente, rimuovere le perle dal campione mediante centrifugazione attraverso colonne spin vuote.Per preparare il passaggio finale di purificazione, scambiare la proteina nel tampone per cromatografia di esclusione molecolare utilizzando unità filtranti centrifughe con cutoff di peso molecolare di 30.000, dopo filtrazione attraverso una siringa filtro da 0,22 micromolare a basso legame proteico. Purificare ulteriormente HSP 1 0 4 mediante cromatografia di esclusione molecolare usando un tampone per cromatografia di esclusione molecolare.Colonna Super OH 6 equilibrata. Eseguire la corsa di FPLC seguendo le istruzioni del produttore. Dopo la purificazione, raccogliere le frazioni di HSP 1 0 4 e concentrarle mediante unità di concentrazione centrifughe; a causa della perdita di materiale durante la separazione dei prodotti di degradazione e delle impurità di HSP 1 0 4, il rendimento finale di HSP 1 0 4 purificata a lunghezza intera è approssimativamente da uno a tre milligrammi per litro di coltura iniziale.Qui è mostrata l'analisi SDS-PAGE della purificazione per affinità al nichel. La proteina HSP 104 marcat&agrave; con istidina, di 105 chilodalton, &egrave; visibile nei campioni prelevati dal lisato, dal carico sulle perle, dal flusso attraverso le perle e dall'eluato delle perle. Si noti che non tutta l'HSP 104 &egrave; in grado di legarsi alle perle di nichel; la cromatografia per affinit&agrave; al nichel &egrave; seguita da una cromatografia a scambio ionico su una colonna Resource Q.La traccia blu rappresenta l'assorbanza a 280 nanometri e la traccia verde rappresenta la percentuale di tampone B. Il primo picco, che eluisce al 20% di B, contiene prodotti di degradazione e impurezze, nonché HSP 1 0 4 mal ripiegata. Il picco principale contiene HSP 1 0 4 correttamente ripiegata e attiva, come indicato dall'analisi mediante SDS-PAGE dopo lo scambio ionico. La proteina HEXA histamina HSP 1 0 4 è soggetta a scissione del tag his mediante il proteasi pro TV.Si noti che la HSP 1 0 4 tagliata migra più rapidamente rispetto alla proteina marcat&agrave; con esa-istidina. La HSP 1 0 4 tagliata &egrave; stata quindi ulteriormente purificata mediante una colonna di filtrazione su gel AUP O sei. Il picco compreso tra le linee tratteggiate rappresenta le frazioni raggruppate.Qui vengono mostrati i risultati del saggio di riattivazione della luciferasi, utilizzato per valutare l'attività di disgregazione di HSP 1 0 4. Aggregati di luciferasi di lucerna denaturata sono stati incubati con HSP 40 e HSP 72, HSP 1 0 4 oppure HSP 1 0 4, HSP 40 e HSP 72. La luciferasi denaturata viene riattivata completamente solo in presenza sia di HSP 1 0 4 che di HSP 40 e HSP 72, come dimostrato dall'ampio aumento della luminescenza. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato in due giorni se eseguito correttamente.

purification-of-hsp104-a-protein-disaggregase

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un romanzo e altamente efficiente in due fasi cromatografia di affinità protocollo è stato sviluppato ed è descritto in dettaglio. Il metodo si basa su un tag purificazione con due affinità intrinseca ed è applicabile ad una vasta gamma di proteine ​​bersaglio con proprietà diverse.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Fonte: Murata, T., et al. Purificazione di una proteina ad alta massa molecolare in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra una procedura passo-passo per la purificazione di una proteina marcata con poliistidina secreta da Streptococcus mutans.

Una procedura per la purificazione di una proteina marcata con poliistidina da Streptococcus mutans

Nel presente protocollo, si dimostra un metodo altamente efficiente e conveniente purificazione di proteine ​​su piccola scala, che permette la purificazione di proteine ​​ricombinanti, combinando in modo univoco un scindibile GST-tag e un piccolo His-tag.

GST-la sua purificazione: A Two-step Affinity Purification protocollo Cedendo Full-length proteine ​​purificate

Questo articolo descrive l'uso di una proteina di fusione GFP-luciferasi lucciola per...

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

I modelli di proteinopatia del lievito sono strumenti preziosi per valutare la tossicità e l'aggregazione delle proteine implicate nella malattia. Qui, presentiamo i metodi per lo screening delle librerie di varianti Hsp104 per i soppressori di tossicità. Questo protocollo potrebbe essere adattato per lo screening di qualsiasi libreria proteica per soppressori di tossicità di qualsiasi proteina tossica nel lievito.

L&#39;isolamento potenziato Hsp104 Varianti Utilizzando lievito Proteinopathy modelle

Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Qui, presentiamo un protocollo robusto e ottimizzato per la produzione di quantità di milligrammo di monomeri nativi, privo di etichetta e fibrille di exon1, della proteina huntingtina (Httex1), basata sulla fusione transitoria del piccolo ubiquitina relative al modificatore (SUMO).

Generazione di monomero Exon1 huntingtina nativo, senza tag e fibrille usando una strategia di fusione di SUMO

Uno della più difficili condizioni di stress che gli organismi si incontrano durante la loro vita comporta un accumulo di ossidanti. Durante lo sforzo ossidativo, le cellule si basano pesantemente su chaperoni molecolari. Qui, presentiamo i metodi utilizzati per indagare la redox-regolati anti-aggregazione attività, nonché monitorare i cambiamenti strutturali che disciplinano la funzione di chaperone utilizzando HDX-MS.

Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

Qui, descriviamo un metodo per purificare enzimi pyrophosphokinase istidina-etichettate e utilizzando la cromatografia su strato sottile di radiomarcato substrati e prodotti di test per l' attività enzimatica in vitro. L'analisi di attività dell'enzima è ampiamente applicabile a qualsiasi chinasi, ciclasi del nucleotide o reazione di fosforo-trasferimento cui meccanismo include idrolisi di trifosfato del nucleotide.

Una purificazione e l'analisi di attività In Vitro per un ppGpp (p) sintetasi da Clostridium difficile

Questo protocollo descrive un metodo di purificazione per la proteina ricombinante di legame del calcio senza tag S100A12 e i suoi oligomeri indotti dagli ioni per i saggi di stimolazione monocite umana.

Purificazione di Human S100A12 e delle sue Oligomeri indotte dallo ione per la stimolazione cellulare immunitaria

Questo articolo descrive una metodologia per sovraesprimere la Nsp15 ricombinante, una nucleasi tossica, in un sistema di espressione C41(DE3), seguita dalla purificazione della proteina marcata utilizzando la cromatografia di affinità e di esclusione dimensionale. Questi protocolli possono essere adattati per altre proteine tossiche impegnative.

Sovraespressione e purificazione di una nucleasi tossica da Escherichia coli

Impara la purificazione di Hsp104, una disaggregasi proteica esamerica AAA+ del lievito, mediante cromatografia di affinità, scambio anionico e filtrazione su gel. Questo protocollo garantisce elevate rese di proteina attiva per studi strutturali e funzionali.

Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

Esplora altri video