Trasfezione mediata da elettroporazione dei gangli della radice dorsale di topo per promuovere la rigenerazione sensoriale degli assoni

Prendi un topo anestetizzato con gangli della radice dorsale L4 e L5 esposti contenenti corpi cellulari neuronali sensoriali.

Caricare una pipetta per microiniezione con costrutti di RNA marcati con fluorofori che regolano la rigenerazione degli assoni e un colorante tracciante.

Iniettare la miscela nei DRG.

Utilizzando elettrodi di elettroporazione, applicare impulsi elettrici ai DRG.

Questo distrugge le membrane dei corpi cellulari dei neuroni sensoriali, creando pori che consentono ai costrutti di entrare nel citoplasma, facilitando la trasfezione.

Sutura l'incisione e lascia che il topo si riprenda.

Dopo alcuni giorni, anestetizzare nuovamente e fissare il mouse.

Fai un'incisione laterale alla linea mediana a sinistra. Sezionare i muscoli per esporre il nervo sciatico.

Schiacciare il nervo per ferire gli assoni dei neuroni sensoriali. Segna il sito con un nodo di sutura.

Sutura l'incisione e lascia che il topo si riprenda.

I costrutti trasfettati mirano agli mRNA bersaglio nei corpi cellulari dei neuroni sensoriali DRG, modulando transitoriamente la produzione di proteine per migliorare la rigenerazione sensoriale degli assoni dopo la lesione.

Per l'iniezione di DRG, caricare i plasmidi di DNA o gli oligo di RNA nella pipetta capillare di vetro. Quindi inserire con cautela la punta della pipetta capillare in vetro nel DRG. E iniettare gradualmente 1 microlitro di plasmidi di DNA o oligo di RNA utilizzando il sistema di erogazione della microiniezione intracellulare.

Per l'elettroporazione, pizzicare delicatamente il DRG target con gli elettrodi e applicare impulsi elettrici a 5 quadrati con il sistema di elettroporazione. Successivamente, chiudere il muscolo, quindi gli strati cutanei con punti di sutura in nylon. Due o tre giorni dopo l'elettroporazione DRG, anestetizzare il topo per via intraperitoneale, fissare gli arti con del nastro adesivo sulla bacheca di sughero e praticare un'incisione di 1 centimetro a 0,5 centimetri sul lato sinistro lungo la linea mediana.

Quindi, taglia longitudinalmente i muscoli, come il muscolo grande gluteo e il muscolo piriforme. Quindi esporre il segmento del nervo sciatico tra il grande forame sciatico e l'incisura sciatica. Schiacciare il nervo con una pinza per microchirurgia per 12 secondi e contrassegnare il sito di schiacciamento con una sutura epineurale in nylon. Successivamente, chiudere gli strati muscolari e cutanei con una sutura di nylon.