JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:33 min • June 17th, 2025
Riempi una siringa con una soluzione contenente virus adeno-associati, o AAV, e lidocaina, un anestetico locale.
Metti un topo sveglio in posizione prona e copri la parte superiore del corpo.
Tieni la cintura pelvica del topo e rasa la parte bassa della schiena per esporre la pelle. Sterilizzarlo con iodio ed etanolo.
Individua lo spazio nella parte inferiore della colonna vertebrale e premi delicatamente per contrassegnarlo.
Ruotare la coda per allineare la colonna vertebrale e inserire la siringa verticalmente.
Regolare l'angolo fino a quando non si verifica un movimento della coda, confermando l'ingresso dell'ago nello spazio intratecale dove scorre il liquido cerebrospinale o il liquido cerebrospinale.
Iniettare lentamente la soluzione per una distribuzione uniforme.
Le particelle virali si legano ai neuroni, entrano all'interno e rilasciano il loro materiale genetico nel nucleo, consentendo un'espressione genica mirata.
La lidocaina blocca temporaneamente i segnali nervosi, causando la paralisi delle gambe a breve termine, confermando il successo della somministrazione nel liquido cerebrospinale.
Questo protocollo stabilisce che la somministrazione intratecale è un metodo efficace per il trattamento delle malattie del SNC.
Prima di iniziare la procedura, collegare un ago calibro 27 a una siringa Hamilton da 25 microlitri e allineare la punta smussata dell'ago con la scala volumetrica sulla siringa, quindi caricare con cura 8 microlitri di 4 volte 10 alla decima copia del genoma della soluzione virale nella siringa, facendo attenzione a evitare bolle.
Successivamente, posiziona un topo sveglio di 30-70 giorni, da 12 a 30 grammi, su un pezzo di letto in posizione prona in un cappuccio di biosicurezza e copri la parte superiore del corpo con una garza sterile per calmare il topo ed evitare di essere morso. Afferrare saldamente il topo sulla cintura pelvica, con il pollice da un lato e l'indice e il medio dall'altro, mantenendo tesa la pelle tra i cingoli pelvici bilaterali con il pollice e l'indice, quindi radere il pelo tra i cingoli pelvici bilaterali e sterilizzare la pelle esposta con uno scrub a base di ioduro ed etanolo al 70%.
Per la somministrazione intratecale diretta della soluzione virale adeno-associata, palpare lo spazio intervertebrale lungo la linea mediana tra i cingoli pelvici bilaterali e utilizzare un'unghia per premere una rientranza nella pelle per indicare lo spazio intervertebrale da L5 a L6. Ruota leggermente e delicatamente la base della coda per rivelare la linea mediana della colonna vertebrale e regola lo smusso dell'ago verso la testa dell'animale. Con il mouse fissato saldamente in posizione, allineare l'ago lungo la linea mediana della colonna vertebrale e inserire l'ago delicatamente e verticalmente al centro della rientranza, mantenendo la siringa su un piano sagittale centrale.
Quando l'ago entra in contatto con l'osso, diminuire lentamente l'angolo a circa 30 gradi e infilare l'ago nello spazio intervertebrale. Un improvviso movimento della coda è un segno di un ingresso riuscito nello spazio intradurale. Quando l'ago entra nello spazio intervertebrale, la punta si sentirà saldamente bloccata. Iniettare la soluzione vettoriale e mantenere l'ago all'interno dello spazio intradurale per un minuto, quindi ritirare lentamente l'ago con la rotazione per ridurre al minimo le perdite.