JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:13 min • August 7th, 2025
Inizia con un topo anestetizzato e applica un agente dilatatore della pupilla.
Al microscopio, aprire la palpebra e sporgere leggermente l'occhio per esporre il sito di iniezione.
Applicare una goccia di soluzione viscoelastica oftalmica, quindi posizionare un vetrino coprioggetti per visualizzare la retina.
Usando un ago sottile, crea un foro dietro la giunzione cornea-sclera, evitando danni ai vasi sanguigni e al cristallino.
Attraverso questo foro pre-perforato, inserire una siringa smussata tangenzialmente nello spazio sottoretinico vicino all'epitelio pigmentato retinico o RPE, che supporta i neuroni retinici.
Iniettare il vettore lentivirale che trasporta i geni bersaglio nello spazio sottoretinico.
Osservare la formazione di una bolla sottoretinica dovuta all'accumulo di liquidi, confermando l'avvenuta consegna del vettore.
Chiudere delicatamente la palpebra per coprire il sito di iniezione e consentire al topo di riprendersi.
Il lentivirus entra nell'RPE attraverso l'endocitosi, rilascia il suo materiale genetico e lo converte nel DNA corrispondente, che si integra con il genoma ospite, consentendo l'espressione genica.
Per prima cosa, prepara una siringa da microlitro con un ago smussato calibro 33. Sterilizzarlo utilizzando gas di ossido di etilene. Successivamente, preparare una diluizione dei vettori virali in PBS in una provetta per microfusibile a circa 1 milione di unità di titolo per microlitro. Ora, quando si carica la siringa, sciacquarla più volte con la soluzione per rimuovere eventuali spazi morti nella siringa. Prendi da 1,5 a 2 microlitri pronti per l'iniezione.
Con l'iniezione del vettore virale preparata, anestetizzare un topo adulto con un'iniezione intraperitoneale di tiletamina, zolazepam e xilazina. Confermare che l'animale è stato anestetizzato dall'assenza di riflessi. Una volta confermata l'anestesia, dilatare le pupille con una goccia di 0,5% di fenilefrina e 0,5% di tropicamide. Ora, sotto un microscopio operatorio, apri la palpebra e sporgi l'occhio per esporre l'equatore. Tenere l'occhio in questa posizione posizionando le dita al di fuori del bordo orbitale.
Quindi, applicare la soluzione viscoelastica oftalmica sulla superficie corneale e posizionare un piccolo vetrino di copertura rotondo sulla cornea. In questo modo, la retina può essere visualizzata. Ora, leggermente posteriormente al limbus, e inferiormente nell'occhio destro, o superiormente nell'occhio sinistro, usa un mezzo ago sterile calibro 30 per fare un piccolo foro. I fori posizionati temporaneamente o nasali non sono buone scelte in quanto sono difficili da coprire.
Durante la foratura, non colpire il vaso limbare o la lente e non inserire l'intero smusso dell'ago.
Per le iniezioni sottoretiniche, inserire l'ago per iniezione del vettore attraverso il foro con un angolo di 45 gradi rispetto al piano dell'iride. Spingere l'ago posteriormente verso l'area peripapillare, seguendo il percorso indicato per attraversare la cavità vitreale. Avvicinare l'ago nello spazio sottoretinico fino a quando non si avverte una lieve resistenza, che indica che lo strato di RPE è stato raggiunto.
Non penetrare nel tessuto sclerale con una pressione eccessiva perché l'ago deve essere posizionato nel potenziale spazio sottoretinico. Se l'ago perfora il tessuto cranico con una potenza eccessiva, entra nello spazio orbitale extraoculare senza resistenza.
Ora, iniettare delicatamente il vettore virale nello spazio sottoretinico. Tenere l'ago molto fermo per evitare danni ai tessuti, che è di vitale importanza. Quindi, estrarre l'ago altrettanto delicatamente. Ora, il bulbo oculare può essere rilasciato. Dovrebbe essere visibile un blebbing sottoretinico indicativo di accumulo di vettori. Infine, chiudere delicatamente la palpebra per coprire il sito di iniezione. Si verificherà l'autosigillatura del foro.