JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:04 min. • August 20th, 2025
La spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR) aiuta a studiare l'autoassemblaggio dei peptidi in strutture supramolecolari tenute insieme da interazioni non covalenti.
Inizia prelevando un campione di proteina non assemblato, una sospensione di peptidi amiloidi con la capacità di formare una struttura supramolecolare ricca di fogli beta. Posizionare il campione in uno strumento FTIR dotato di un cristallo ATR.
Dirigere un raggio infrarosso ad un angolo critico sul cristallo; il raggio lo attraversa e colpisce l'interfaccia tra il cristallo e il campione. I cristalli con un indice di rifrazione più elevato rispetto al campione causano la riflessione interna del fascio.
Una piccola frazione del raggio si estende nel campione come un'onda evanescente, un'onda stazionaria nei punti di riflessione. L'interazione di questa onda con il campione provoca l'assorbimento dell'energia dell'onda, portando all'attenuazione del raggio riflesso, registrato da un rivelatore.
A seconda della struttura del peptide, il campione assorbe in regioni specifiche dello spettro infrarosso. Lo spettro di assorbimento, ottenuto dalla trasformazione di Fourier del segnale, mostra un ampio picco a un numero d'onda specifico, caratteristico del campione di proteina non assemblato.
Incubare il campione, consentendo l'autoassemblaggio, per formare fibre amiloidi ricche di fogli beta. Dopo l'incubazione, registrare lo spettro di assorbimento.
Un picco acuto a un numero d'onda diverso dal precedente picco generale indica la conversione in un assemblaggio di fogli beta.
Per preparare una soluzione autoassemblante, sciogliere 1 milligrammo di polvere di peptide liofilizzato in una miscela di acetonitrile al 20% e HEPES da 10 millimolari in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, agitare la soluzione di assemblaggio e lasciare che il campione si assembli a temperatura ambiente.
Quando l'assemblaggio peptidico raggiunge la maturazione, asciugare da 8 a 10 microlitri della soluzione di assemblaggio come un film sottile sul cristallo di diamante a riflessione totale attenuato e monitorare la scomparsa di un picco d'acqua grande e largo da 1.640 a 1.630 centimetri inversi mentre si forma il film secco.
Acquisisci spettri di fondo e infrarossi da 1.500 a 1.800 centimetri inversi, con una media di 50 scansioni con una risoluzione di 2 centimetri inversi, sottraendo le scansioni di sfondo prima di ogni scansione del campione.
La firma infrarossa per l'assemblaggio del foglio beta dovrebbe essere osservata come un picco netto compreso tra 1.625 e 1.635 centimetri inversi.