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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:53 min • August 7th, 2025
Prendi un cucciolo di topo anestetizzato con perdita dell'udito indotta geneticamente.
In questa condizione, le cellule ciliate nell'orecchio interno mancano di trasportatori di glutammato, impedendo al glutammato di essere impacchettato nelle vescicole e rilasciato.
Ciò interrompe la trasmissione dei segnali sonori al nervo uditivo.
Radere il topo dietro l'orecchio sinistro, disinfettare e applicare un unguento per gli occhi.
Estendi il collo e fai un'incisione.
Ritrarre il tessuto adiposo e i muscoli per esporre l'osso temporale.
Perforare la bolla timpanica, parte dell'osso temporale, e allargare l'apertura per esporre la membrana rotonda della finestra o RWM, una sottile barriera all'orecchio interno.
Pungere l'RWM e iniettare il vettore virale adeno-associato che trasporta il gene terapeutico.
Le particelle virali si diffondono ed entrano nelle cellule ciliate.
All'interno delle cellule ciliate, le particelle virali consegnano il loro materiale genetico al nucleo, innescando la produzione di trasportatore di glutammato.
Ciò consente l'impacchettamento e il rilascio del glutammato, ripristinando la segnalazione sonora al nervo uditivo.
Dopo aver confermato l'anestesia con un pizzico di dita, radere la regione postauricolare sinistra e disinfettare la pelle di un topo postnatale dal giorno 10 al 12 con etanolo al 70% e iodio povidone. Quindi coprire gli occhi con un unguento oftalmico protettivo e posizionare l'animale con il collo esteso su un termoforo. Al termine della preparazione chirurgica, incidere il tessuto sottocutaneo con piccole forbici per esporre il muscolo postauricolare. Dopo aver retratto il tessuto adiposo sul lato posteriore dell'incisione, separare i muscoli ai lati destro e sinistro, perpendicolarmente all'incisione.
Per esporre l'osso temporale. Utilizzare un ago calibro 25 per perforare la bolla timpanica. Sbucciare l'osso con una pinza se necessario per espandere il foro e per consentire l'accesso al giro basale della coclea.
Quindi, allargare il foro a sufficienza per consentire la visualizzazione dell'arteria stapediale e della membrana rotonda della finestra. Forare delicatamente la membrana rotonda della finestra al centro con una pipetta capillare in borosilicato. Asciugare la membrana rotonda della finestra con una carta da filtro sterile. Quindi attendere da cinque a dieci minuti affinché l'efflusso di fluido si stabilizzi.
A questo punto, fare attenzione quando si tiene e si avanza la pipetta, in modo da rendere la perforazione della membrana della finestra rotonda il più piccola possibile. A seconda dell'uso del microscopio, la pipetta può essere tenuta a mano o con un micromanipolatore. Come puoi vedere qui, teniamo la pipetta a mano, poiché il microscopio è troppo vicino al mouse per consentire un micromanipolatore.
Ora, aspirare uno o due microlitri di virus in una pipetta di vetro tirata con una punta di 15 micrometri di diametro e microiniettare il virus nella scala timpano attraverso lo stesso foro precedentemente praticato nella membrana rotonda della finestra.