Name: Purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito Highly Active (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Impara la purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito altamente attivi. Questo metodo rapido separa i ribosomi da esonucleasi e proteasi, migliorando l'affidabilità delle analisi biochimiche e strutturali.

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Desideriamo ringraziare tutti i membri del laboratorio Dinman, tra Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, e Michael Rhodin per il loro aiuto e l&#39;ingresso su questo progetto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni a AM dalla American Heart Association (AHA 0630163N) e JDD dal National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL è stata sostenuta da un reinvestimento americano e Recovery Act del 2009, supplemento alla concessione genitore (3R01GM058859-11S1).

1. Preparazione di un cisteina carica Sulfolink resina <ol><li> Preparare Sulfolink resina (Pierce) a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare un totale di 10 ml di una emulsione al 50% di gel di accoppiamento Sulfolink come fornito dal produttore in due flaconcini da 10 ml in plastica, con 5 ml distribuito in ciascuna provetta. </li><li> Centrifugare brevemente fiale a 850 xg e rimuovere con attenzione surnatanti. </li><li> Lavare il gel tre volte in un tampone di accoppiamento (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) da risospendere le perle in 5 ml, centrifugazione a 850 xg brevemente e rimuovere il surnatante tramite pipetta. </li><li> Aggiungere cinque ml di una soluzione 50 mM di L-cisteina in un tampone di accoppiamento a ciascuna provetta e miscelare l'impasto per 1 ora a 25 ° C. </li><li> Rimuovere il residuo di L-cisteina con il lavaggio come descritto al punto 1.4. </li><li> Risospendere il gel in 10 ml di tampone vincolante [20 HEPES mM, pH 7,6, 5 mM Mg (OAC) 2, 60 mM di NH 4 Cl, 2 mM DTT] ed equilibrare la resina con il lavaggio in 10 ml di tampone vincolante3 volte come descritto al punto 1.4. Resina decantare in una centrifuga da 10 ml colonna, calotta e conservati a 4 ° C. La capacità di resina per l'RNA legame è ~ 20 A 260 unità per ml. </li></ol> 2. Purificazione cromatografica dei ribosomi con una cisteina carica Sulfolink resina Nota: Se si lavora con un ceppo dove l'attività della proteasi si rivela essere un problema, cocktail inibizione della proteasi può essere utilizzato in tutti i buffer successive. <ol><li> Mantenere tutti i componenti su ghiaccio e preparare tutte le soluzioni con RNase-free acqua e filtrazione sterile. </li><li> Crescere cellule di lievito durante la notte a metà fase di log (OD 595 = 0,6-1,2) nelle matrici appropriate. Celle a pellet per centrifugazione, e lavare 1 grammo cellule in un tampone di legame e centrifugare a 3700 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di tampone legame con un volume totale approssimativo di 2 ml, e di interrompere con un uguale volume di perle di mm 0,5 di vetro refrigerate a 4 ° C ucantare una Biospec Mini-tallone battitore (Bartlesville, OK). I campioni possono essere suddivisi in tubi multipli, se necessario. </li><li> Rimuovere le cellule ininterrotta, organelli e detriti cellulari mediante centrifugazione a 30.000 xg per 30 minuti in un Beckman-Coulter ultracentrifuga Optima Max E (Fullerton, CA). </li><li> Immediatamente prima dell'uso, pellet la resina per un minuto a 1.000 xg per rimuovere la soluzione di storage. Due ml di resina viene utilizzato per ogni grammo di cellule. </li><li> Rimuovere surnatanti lisato cellulare dallo spin 30.000 xg (S30), avendo cura di minimizzare la contaminazione sia dalla frazione lipidica in cima o detriti cellulari alla base dei tubi, e posto direttamente nel liquame Sulfolink carica. Lo strato lipidico possono essere evitati o per la rimozione o spingendo fuori dalla pipetta dopo che la punta ha attraversato nel surnatante. </li><li> Incubare la miscela S30/Sulfolink sul ghiaccio senza mescolare per 15 minuti. </li><li> Posizionare le colonne in provette da 15 ml e centrifugare a 1000 xg perr un minuto. </li><li> Posizionare le frazioni eluato nuovamente dentro le colonne, mescolare a mano, e incubare per altri 15 minuti in ghiaccio. </li><li> Posizionare le colonne in provette da 15 ml e centrifugare a 1000 xg per un minuto. Eliminare l'eluato. </li><li> Colonne tappo e aggiungere 5 ml di tampone vincolanti. Mescolare le colonne a mano fino risospeso, rimuovere i tappi, e centrifugare la centrifuga colonne a 1.000 xg per un minuto. Ripetere questo protocollo di lavaggio altre due volte. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di tampone di eluizione (20 mM HEPES-KOH a pH 7,6, 10 mM Mg (OAC) 2, 500 mM KCl, 2mM DTT, 0,5 mg / ml di eparina) per ogni colonna. Mescolare impasti a mano, e incubare in ghiaccio per 2 minuti </li><li> Colonne posto in nuove provette da 15 ml e centrifugare a 1000 xg per 1 minuto. Raccogliere eluato. Ripetere il passaggio di eluizione una volta di più che il volume finale del campione combinato sono circa 3 ml. Resina utilizzata può essere lavata con tampone di eluizione senza eparina seguita da equilibrio con buffe vincolanter, e conservati in volumi di 10 ml di tampone vincolante a 4 ° C per il riutilizzo in seguito. </li></ol> 3. Puromicina trattamento Nota: Un metodo alternativo per rimuovere contaminanti specie di tRNA è quello di passare da una ricca glucosio glucosio impoverito ai media per promuovere il deflusso ribosoma. Tuttavia, questo non cambia lo stato metabolico delle cellule di lievito, che potrebbero influenzare la funzione dei ribosomi e la concentrazione. Al fine di spogliare i ribosomi da endogene peptidil-tRNA, un trattamento viene eseguito con puromicina. <ol><li> Neutralizzare al pH 7.5 100 mM puromicina soluzione con l'aggiunta di KOH 1M goccia a goccia a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere la soluzione puromicina neutralizzata a concentrazione finale di 1 mM ~ eluato. </li><li> Aggiungere 100 mM GTP ad una concentrazione finale di 1 mm. </li><li> Incubare per 30 minuti a 30 ° C. </li></ol> 4. Purificazione dei ribosomi per sedimentazione attraverso cuscini glicerolo <ol><li> Mettere un mldi tampone cuscino (20 HEPES mM, pH 7,6, 10 mM Mg (OAC) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 25% glicerolo) in un tubo 4 volumi ultracentrifuga ml in policarbonato. </li><li> Delicatamente strato puromicina trattati frazioni di eluizione in cima al cuscino, e campioni di centrifugare a 100.000 xg notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere i tubi dal rotore centrifuga, ed aspirare surnatanti. </li><li> Lavare pellet contenenti ribosomi purificati due volte con 1 ml di tampone cuscino. </li><li> Risospendere ribosomi in 100 ml di tampone cuscino dalla rottura dolce utilizzando una bacchetta di vetro. </li><li> Dopo la rottura, coprire i tubi con parafilm e agitare ad una velocità moderata in un vortice stanza fredda per un'ora. </li><li> Trasferire il contenuto in una provetta, centrifugare per 5 minuti a velocità massima a 4 ° C, e rimuovere surnatanti ai tubi fresca. </li><li> Ripetere i passaggi 4,1-4,7 con 2 ml di tampone cuscino e, tranne che 100 microlitri di buffer di memorizzazione (50 mM HEPES-KOH a pH 7,6, 50 mM di NH 4 Cl, 5 mM Mg(OAC) 2, 1 mM DTT, 25% glicerolo) è usato in passi 4.4 e 4.5 invece di buffer di cuscino. </li><li> Quantificare i ribosomi purificati spettrofotometricamente (1 A 260 = 20 pmoli dei ribosomi lievito), e conservare a -80 ° C. I risultati tipici da 1 grammo di lievito sono 300-400 pmoli dei ribosomi. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un esempio di specie di RNA estratto da ciascuna delle tre fasi principali del protocollo è mostrato nella Figura 2. Mentre rRNA sono le specie principali presenti in lisati cellulari totali (T) anche questi contengono un gran numero di altre specie di RNA. Ribosomi purificati dalla colonna Sulfolink (SL) contengono anche una grande quantità di tRNA a causa della elevata affinità del letto della colonna per queste specie. Il trattamento di questa frazione con risultati puromicina in idrolisi di peptidi da peptidil-tRNA, e promuove la dissociazione di queste specie da ribosomi. Il puromicina trattati campioni (Pm) la mancanza di co-purifying specie di tRNA, ribosomi e rappresentano quindi completamente puro. Come riportato in precedenza 8, dette ribosomi sono altamente intatti e biochimicamente attive, che li rende ideali per substrati dettagliate analisi funzionali e strutturali. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso metodo. Purificazione cromatografica dei ribosomi con il cisteina legate sulfolink resina è raffigurato. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Analisi rappresentante di preparati ribosoma. Totale specie di RNA sono stati estratti da lisati cellulari totali (T), Sulfolink ribosomi purificati (SL) e Sulfolink purificata ribosomi successivamente trattati con puromicina e sedimentate attraverso un cuscino glicerolo (Pm). Corsia M rappresenta segnataglie RNA. Bande che rappresentano rRNA 25S e 18S, così come tRNA e altre specie di RNA sono indicati. Tutticorsie sono stati caricati con 2 mg di RNA.

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
<li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li>
<li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li>
<li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li>
<li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purity%2C+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li>
<li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast%3A+evidence+for+three+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis%3A+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li>
<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
<li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li>
<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Protocolli di purificazione ribosoma fondamentalmente coinvolgere le cellule di lisi, raccolta una frazione citosolica da un testacoda a bassa velocità, e poi cubettatura ribosomi tramite centrifugazione ad alta velocità 1. Mentre un paio di nuovi metodi sono stati utilizzati per purificare i ribosomi batterici, lo stesso non fosse stato vero per eucarioti 2-4. Anche se ulteriori passi sono stati aggiunti nel corso degli anni, si lava sale ad esempio, e cuscini glicerolo (ad esempio vedi 5),</...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Sulfolink Giunto in resina </td><td> Perforare </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini bead-beater 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max E ultracentrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Legenda RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> Perle di vetro 0,5 millimetri </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAC) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito highly active

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Ribosomi eucariotici sono molto più labili rispetto alle loro controparti eubatteri e archael, ponendo così una sfida significativa per i ricercatori. Particolarmente fastidioso è il fatto che la lisi delle cellule rilascia un gran numero di proteasi e nucleasi che può degradare i ribosomi. Quindi, è importante separare i ribosomi di questi enzimi nel più breve tempo possibile. Purtroppo, i metodi convenzionali ultracentrifugazione differenziale lascia ribosomi esposti a questi enzimi per periodi troppo lunghi di tempo, che influiscono sulla loro integrità strutturale e la funzionalità. Per risolvere questo problema, utilizziamo un metodo cromatografico utilizzando una cisteina carica Sulfolink resina. Questa applicazione semplice e rapida riduce in modo significativo le attività di co-purificazione proteolitici e nucleolytic, producendo rendimenti elevati di intatto, ribosomi lieviti altamente biochimicamente attivi. Suggeriamo che questo metodo dovrebbe essere applicabile anche ai ribosomi dei mammiferi. La semplicità diil metodo, e la purezza maggiore e l&#39;attività del ribosoma cromatograficamente purificato rappresenta un progresso tecnico significativo per lo studio dei ribosomi eucarioti.

Contaminazione di preparati di ribosomi eucarioti purificata con metodi tradizionali da parte di co-purificazione nucleasi e proteasi influisce negativamente sulla valle analisi biochimiche e strutturali. Un metodo rapido e semplice purificazione cromatografica viene utilizzato per risolvere questo problema utilizzando ribosomi lievito come sistema modello.

Purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito Highly Active

I ribosomi eucariotici sono molto più labili rispetto alle loro controparti eubatteriche e archeali, rappresentando quindi una sfida significativa per i ricercatori.

L'obiettivo generale di questa procedura è purificare ribosomi di lievito integri e altamente attivi. Questo risultato si ottiene innanzitutto lisando le cellule e chiarificando il lisato mediante centrifugazione ad alta velocità. Per ottenere la frazione S 30, si utilizza quindi una colonna con legame SFO carica di cisteina per purificare i ribosomi.Successivamente, viene effettuata la rimozione degli tRNA contaminanti mediante trattamento con puromicina come passaggio finale di purificazione. I ribosomi sono sottoposti a ultracentrifugazione ad alta velocità. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la purificazione mediante ultracentrifugazione, è che l'uso della colonna sulfa link separa rapidamente i ribosomi dagli esonucleasi e proteasi contaminanti.Inoltre, il passaggio di trattamento con puromicina separa i ribosomi dalle specie di RNA contaminanti, come i tRNA. Questi passaggi garantiscono la produzione di elevate rese di ribosomi purificati altamente attivi e integri, da utilizzare in studi biochimici e strutturali. La procedura sarà dimostrata da Jonathan Leschen, ricercatore post-dottorato del mio laboratorio.Iniziare il protocollo pipettando una sospensione al 50% di gel di accoppiamento sulfa link, fornito dal produttore, in due vial di plastica da 10 millilitri, distribuendo cinque millilitri in ciascun vial. Dopo una breve centrifugazione dei vial a 850 ×g, rimuovere con attenzione i soprannatanti. Lavare il gel tre volte con tampone di accoppiamento, risospendendo le perle in cinque millilitri di tampone e quindi centrifugando brevemente a 850 ×g. Rimuovere il soprannatante mediante pipetta. Dopo il lavaggio della resina, aggiungere cinque millilitri di una soluzione 50 millimolare di L-cisteina nel tampone di accoppiamento in ciascun tubo.Mescolare il sospeso per un'ora a 25 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere la L-cisteina residua lavando la resina tre volte con il solo tampone di accoppiamento. Quindi, risospendere il gel in 10 millilitri di tampone di legame ed equilibrare la resina lavandola tre volte.Infine, versare la resina in una colonna da centrifuga da 10 millilitri e chiuderla con il tappo. La resina può essere conservata a quattro gradi Celsius ed ha una capacità di circa 20 a due 60 unità per millilitro durante la purificazione cromatografica dei ribosomi. Utilizzando una resina solfo-legante caricata con cistina.Mantenere tutti i componenti sul ghiaccio e preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua priva di RNAsi e filtrazione sterile. Far crescere le cellule di lievito per tutta la notte fino alla fase logaritmica media nel mezzo appropriato. Dopo aver pellettizzato le cellule mediante centrifugazione, lavare un grammo di cellule in buffer di legame e centrifugare nuovamente, quindi risospendere le cellule in un millilitro di buffer di legame fino a un volume totale approssimativo di due millilitri.Disperdere le cellule utilizzando un volume uguale di perle di vetro da 0,5 millimetri raffreddate a quattro gradi Celsius, insieme a un mini agitatore a perle. Rimuovere le cellule non rotte, gli organelli e i detriti cellulari mediante centrifugazione a 30.000 ×g per 30 minuti in un ultracentrifugo. Nel frattempo, pellettizzare la resina per un minuto a 1000 ×g. Rimuovere immediatamente la soluzione di conservazione subito prima dell'uso.Due millilitri di resina vengono utilizzati per ogni grammo di cellule. Dopo l'ultracentrifugazione dei campioni, rimuovere i soprannatanti del lisato cellulare dalla centrifugazione a 30.000 volte G, denominata S 30. Prestare attenzione a minimizzare la contaminazione sia dalla frazione lipidica in cima sia dai detriti cellulari sul fondo dei tubi.Trasferire i soprannatanti direttamente nella sospensione di SFO link carica. Incubare la miscela S 30 SFO link sul ghiaccio per 15 minuti. Posizionare le colonne in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare a 1000 ×g per un minuto; trasferire le frazioni di flusso in eccesso nuovamente nelle colonne, chiudere le colonne e capovolgerle per mescolare.Incubare i campioni per ulteriori 15 minuti sul ghiaccio. Quindi posizionare le colonne in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare a 1000 ×g per un minuto, scartando il flusso passante. Dopo aver aggiunto cinque millilitri di buffer di legame, chiudere le colonne con il tappo e capovolgerle per mescolare fino a completa risospensione.Rimuovere i tappi e centrifugare le colonne a 1000 ×g per un minuto. Ripetere questa procedura di lavaggio altre due volte. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di tampone di eluizione a ciascuna colonna.Mescolare i sospesi manualmente e incubare sul ghiaccio per due minuti. Come passaggio finale, posizionare le colonne in nuovi tubi conici da 50 millilitri e centrifugare a 1000 ×g per un minuto; raccogliere l’eluito e ripetere il passaggio di eluizione un’altra volta in modo che il volume finale combinato dei campioni sia di circa tre millilitri. Per rimuovere i ribosomi dal peptidil endogeno, viene eseguito un trattamento con puromicina del T-R-N-A-A.Per prima cosa, neutralizzare una soluzione di pur micina 100 millimolare a pH 7,5 aggiungendo idrossido di potassio 1 molare goccia a goccia. Aggiungere a temperatura ambiente. Aggiungere la soluzione di pur micina neutralizzata fino a una concentrazione finale di circa un millimolare nell'eluito.Quindi aggiungere GTP 100 millimolari fino a una concentrazione finale di un millimolare. Incubare la miscela per 30 minuti a 30 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, versare un millilitro di buffer cuscinetto in un tubo per ultracentrifuga in policarbonato da quattro millilitri.Aggiungere delicatamente le frazioni di eluizione trattate con puromicina sopra il cuscino e centrifugare i campioni a 100.000 ×g per tutta la notte. Dopo aver aspirato i soprannatanti, lavare i pellet contenenti i ribosomi purificati con un millilitro di buffer del cuscino. Ripetere il lavaggio con un secondo millilitro di buffer del cuscino.Quindi Reza sospese i ribosomi in 100 microlitri di buffer cuscinetto mediante leggera rottura usando una bacchetta di vetro. Successivamente, coprì i tubi con parafilm e agitò a velocità moderata in un vortice in ambiente freddo. Dopo un'ora di agitazione, trasferì il contenuto in una provetta da microcentrifuga e centrifugò per cinque minuti alla velocità massima a quattro gradi Celsius.Trasferire i soprannatanti in provette pulite. Sovrapporre i soprannatanti su due millilitri di buffer cuscinetto in una provetta per ultracentrifuga, quindi centrifugare a 100.000 × g per tutta la notte. Il giorno successivo, rimuovere le provette dal rotore della centrifuga ed aspirare i soprannatanti.Utilizzando il metodo appena descritto, lavare i pellet e risospendere i ribosomi con il buffer di conservazione. Infine, quantificare spettrofotometricamente i ribosomi purificati prima di conservarli a meno 80 gradi Celsius.Qui viene mostrato un esempio di specie di RNA estratte da ciascuna delle tre fasi principali del protocollo, inclusi i lisati cellulari totali, i ribosomi purificati con sulf olink, i ribosomi purificati con sufu link successivamente trattati con pur micina e sedimentati attraverso un cuscino di glicerolo. Sono mostrati anche marcatori di dimensione dell'RNA, mentre i nostri RNA costituiscono le specie principali presenti nei lisati cellulari totali. Questi contengono inoltre un elevato numero di altre specie di RNA.I ribosomi purificati dalla colonna sulfa link contengono una grande quantità di tRNA a causa dell'elevata affinità del letto della colonna per queste specie. Il trattamento di questa frazione con piro micina provoca l'idrolisi dei peptidi dai tRNA peptidilici e favorisce la dissociazione di queste specie dai ribosomi. I campioni trattati con micina pura non presentano specie di tRNA co-purificate e rappresentano quindi ribosomi completamente puri.Come riportato in precedenza, questi ribosomi sono altamente integri e biochimicamente attivi, rendendoli substrati ideali per analisi funzionali e strutturali dettagliate. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come saggi per monitorare il legame di ligandi ai ribosomi e analisi strutturali, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio: quali sono le proprietà biochimiche e biofisiche dei ribosomi eucariotici.

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