Sviluppo di un unilateralmente lesionata 6-OHDA modello murino della malattia di Parkinson

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un modello murino di parkinsonismo. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando i farmaci necessari per l'intervento chirurgico. Il passo successivo consiste nell'allestire l'apparato chirurgico, quindi si esegue un'operazione chirurgica lesiva unilaterale con sei idrossidopamina, seguita da un'adeguata assistenza postoperatoria.

Gli animali lesi con la sestrossi-dopamina possono essere utilizzati per esperimenti comportamentali. Alla fine, i risultati mostrano una deplezione della dopamina superiore al 95% nel fascio mediale dei quattro nervi cerebrali in modo unilaterale. I due aspetti più importanti di questa procedura a cui gli sperimentatori devono prestare attenzione sono, in primo luogo, una corretta assistenza postoperatoria per garantire la sopravvivenza degli animali.

E in secondo luogo, prestare attenzione alla preparazione dell'apparecchiatura per l'infusione di sei idrossi dopamina, per garantire un'erogazione completa della neurotossina. Per iniziare questa procedura, sterilizzare gli strumenti chirurgici in un autoclave. Successivamente, pulire tutte le superfici e l'apparecchiatura con alcol isopropilico.

Quindi preparare il post-operatorio predisponendo una gabbia di recupero per il topo con fazzoletti di carta alla base. Posizionare la gabbia sotto una lampada riscaldante o su un tappetino riscaldato per allestire il carrello per l'anestesia. Assicurarsi che il flusso di ossigeno sia collegato e aperto e che la riserva di isoflurano sia completamente piena.

Dopodiché, impostare il flusso di ossigeno al 1% e l'isoflurano dal 2 al 4%. Il passo successivo consiste nell'assemblare l'apparato di infusione. Infilare un dado metallico RN su un lato del tubo peak, seguito dalla coppa peak feral. Quindi, posizionare il feral PFA canonico orientando i feral in modo che il cono sul feral PPFA canonico si inserisca nella parte abbinata della coppa peak feral.

Quindi inserire la coppa del picco accoppiata e il PFA canonico sterile in ciascuna estremità del raccordo RN a doppio attacco piccolo e serrare il dado metallico RN all'altra estremità del raccordo RN a doppio attacco piccolo. Inserire un ago da iniezione calibro 33. Far passare l'ago attraverso uno dei dadi metallici RN e avvitarlo saldamente.

Assicurarsi che l'ago da 33 gauge sia ad un angolo di 180 gradi rispetto al connettore RN a doppio piccolo attacco. Successivamente, all'altro estremo del tubo Peak, avvitare uno dei dadi metallici RN seguito da un bicchierino Peak feral. Quindi inserire il feral PFA nella scanalatura più profonda del secondo connettore RN a doppio piccolo attacco e stringere il dado metallico RN per fissare il collegamento.

Successivamente, all'estremità opposta del secondo piccolo connettore doppio per hub RN, inserire l'esca nell'adattatore per hub piccolo RN e stringere il dado metallico RN dell'esca per fissare il collegamento. L'allestimento dell'apparato di infusione è ora completo. Un altro passaggio preparatorio consiste nell'espurgare l'apparato di infusione.

Per prima cosa, riempire le siringhe Hamilton da 250 microlitri e da un microlitro con acqua sterile. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Quindi, collegare la siringa da 250 microlitri all'adattatore del lure e premere lo stantuffo della siringa da 250 microlitri in modo che l'acqua fuoriesca attraverso l'ago di iniezione da 33 gauge all'altra estremità del tubo.

Continuare a spingere l'acqua attraverso il sistema mentre si estrae la siringa da 250 microlitri dall'adattatore dell'esca. Lasciando una piccola goccia d'acqua all'estremità dell'adattatore dell'esca, premere lo stantuffo della siringa da un microlitro finché non viene espulsa una piccola goccia d'acqua. Successivamente, inserire con attenzione la siringa da un microlitro nell'adattatore dell'esca.

Assicurarsi che il menisco d'acqua sulla siringa da un microlitro entri in contatto con il menisco d'acqua sull'adattatore del lure. Inserire quindi completamente la siringa da un microlitro nell'adattatore del lure e verificare che non siano presenti bolle nel connettore piccolo a doppio attacco RN. Fissare ora l'apparato di perfusione al telaio stereotassico e utilizzare la pompa di infusione per bloccare il connettore piccolo a doppio attacco RN con l'ago di iniezione da 33 gauge al braccio del manipolatore del telaio stereotassico.

Quindi fissare la siringa da un microlitro alla pompa di perfusione. Successivamente, impostare la pompa di infusione in modo da consentire una velocità di infusione di 0,1 microlitri al minuto, 30 minuti prima dell'intervento. Pesare l'animale e registrarne il peso.

Somministrare una miscela di 2,5 milligrammi per millilitro di cloridrato di dopamina e 0,5 milligrammi per millilitro di cloridrato di parline per iniezione intraperitoneale al topo, alla dose di 10 millilitri per chilogrammo. Successivamente, posizionare un disco riscaldante sotto le barre per le orecchie e la barra per l'incisivo per mantenere la temperatura dell'animale durante l'intervento chirurgico e mantenere l'animale a un'altezza ideale per adattarsi alle barre per le orecchie e per l'incisivo del stereotassico. Inquadrare 15 minuti dopo la somministrazione della miscela di cloridrato di dopamina e cloridrato di parline.

Posizionare il mouse in una camera chiusa per crisi. Anestetizzare l'animale mediante inalazione di isoflurano. L'animale è sufficientemente anestetizzato quando non mostra risposta alla pinzatura della zampa posteriore e non presenta riflesso palpebrale.

Quindi rasare la parte superiore della testa del topo. A questo punto, posizionare il topo nel telaio stereotassico. Inserire la barra degli incisivi nella sua bocca e una maschera per l'anestesia sul suo volto.

Quindi regolare la portata di isoflurano. Applicare l'anestetico topico lidocaina direttamente sulla pelle utilizzando ovatta. Regolare la barretta incisiva e le coppe auricolari per livellare la parte superiore del cranio.

Quindi sterilizzare la pelle con soluzione di Betadine. Successivamente, inserire i coni auricolari. I coni auricolari sono inseriti correttamente quando la testa è completamente piatta e non può essere spostata in nessuna direzione.

Successivamente, praticare un'incisione lungo la linea mediana della testa utilizzando una lama da bisturi ed esporre la superficie cranica. Asciugare la superficie del cranio con una garza. Premere lo stantuffo della siringa da un microlitro ed inserire l'ago da iniezione di calibro 33 nel tubo da un millilitro contenente 15 milligrammi per millilitro.

Soluzione di sei idrossi dopamina coperta con carta stagnola. Tirare lentamente lo stantuffo indietro mantenendo l'ago di iniezione da 33 gauge immerso nella soluzione di sei idrossi dopamina. Successivamente, avanzare la punta dell'ago di iniezione verso la B bgma e rilasciare una piccola quantità di soluzione di sei idrossi dopamina per formare una piccola goccia.

Quindi abbassare lentamente la punta dell'ago di iniezione fino al forame. Quando la perlina tocca il bgma, arrestare l'avanzamento dell'ago e registrare queste coordinate. Ritirare l'ago di iniezione di due millimetri in direzione dorsale e spostarsi lungo la sutura sagittale in direzione rostrale verso Lambda.

Quando si trova sopra Lambda, dispensare una piccola quantità di soluzione di sei idrossi dopamina dall'ago di iniezione in modo da formare una piccola goccia. Quindi abbassare lentamente la punta dell'ago fino a Lambda. Quando la goccia tocca Lambda, interrompere l'avanzamento dell'ago e registrare queste coordinate.

Le coordinate mediale-laterali e dorso-ventrali devono essere identiche per BMA e Lambda. Se non lo sono, regolare la barra degli incisivi di conseguenza. Per le coordinate antero-posteriori e le barre auricolari relative alle coordinate mediale-laterali, spostare l'ago fino alle coordinate di iniezione.

AP meno 1,2 millimetri ml meno 1,1 millimetri rispetto al reame dispensare una piccola quantità di soluzione dall'ago di iniezione al fine di formare una piccola goccia. Abbassare la piccola goccia sul cranio per segnare il punto in cui verrà praticato il foro. Quindi ritrarre l'ago e praticare un foro nel cranio utilizzando un ago da 25 gauge.

Riportare l'ago di iniezione alle coordinate di iniezione e inserire l'ago a meno cinque millimetri lungo la direzione dorso-ventrale. Successivamente, infondere 0,2 microlitri di sei idrossi dopamina o di soluzione veicolare unilateramente nel fascio mediale del prosencefalo a un flusso di 0,1 microlitri al minuto. Al termine dell'amministrazione della sei idrossi dopamina o del veicolo, lasciare l'ago in sede per altri cinque minuti per consentire la diffusione dal sito di iniezione.

Successivamente, ritirare lentamente l'ago, chiudere l'incisione del cuoio capelluto con tre punti di sutura, quindi somministrare un millilitro di soluzione di Ringer lattato per via sottocutanea. Infine, rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e posizionarlo nella gabbia di recupero fino al ripristino della coscienza. Da 15 a 21 giorni dopo l'intervento chirurgico con lesione da sei idrossidopamina.

Quando la quantità di morte cellulare causata dal neurotossico ha raggiunto il completamento, è possibile misurare rotazioni spontanee di 360 gradi per valutare l'efficacia della lesione da sei idrossi dopamina. In questa valutazione comportamentale, i topi con una deplezione dopaminergica indotta da sei idrossi dopamina superiore al 95% mostrano un numero significativamente maggiore di rotazioni spontanee ipsilaterali rispetto ai topi con lesione parziale da sei idrossi dopamina o sottoposti a intervento fittizio. Correlando i livelli di dopamina SAL con la percentuale di rotazioni spontanee ipsilaterali in ciascun animale, si osserva che i topi che presentano il 70% o più di rotazioni ipsilaterali dopo la lesione da sei idrossi dopamina hanno perduto oltre il 95% della dopamina SAL.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire in modo efficace una lesione stereotassica e controllata mediante perfusione di sei idrossi dopamina nei topi. Questo porterà a un livello di deplezione della dopamina superiore al 95%. Inoltre, si dovrebbe comprendere come effettuare la valutazione comportamentale del parkinsonismo nei topi.