High-throughput per l'analisi Saccarificazione materiali lignocellulosici

Ciao, sono Kara Ted, sono Leo. Vai a me. E io sono Simon McQueen Mason.

La digeribilità delle biomasse vegetali è un argomento di grande interesse al momento attuale. Questo perché ci sono molti zuccheri legati nei polisaccaridi delle pareti cellulari delle piante che compongono questa biomassa, e se riusciamo a estrarre quegli zuccheri nella forma utilizzabile, possiamo fermentarli per produrre tutti i tipi di prodotti come combustibili e prodotti chimici. Sfortunatamente, questi materiali sono estremamente difficili da digerire e capire meglio cosa controlla la digeribilità è una questione di una certa urgenza.

Quindi, per essere in grado di utilizzare il materiale vegetale per la produzione di gruppi di rinnovo, dobbiamo essere in grado di misurare il potenziale di ificazione in questi impianti. Quindi, qui all'Università di York, stiamo esaminando grandi popolazioni di materiale vegetale per determinare il loro potenziale di ficazione. La ficazione è il processo di scomposizione dei carboidrati complessi nei suoi componenti monosaccaridici per produrre sostanze chimiche preziose attraverso diversi processi industriali.

Per misurare il potenziale di ficazione, riproduciamo processi industriali a livello di microscala in cui sottoponiamo la biomassa a un pretrattamento e all'idrolisi enzimatica per determinare gli zuccheri rilasciati. Questo identifica varietà interessanti nei genotipi. Il sistema ad alta produttività funziona in un formato di piastra IG a sei pozzetti.

Le condizioni lievi di idrolisi vengono utilizzate per esporre sottili differenze tra i genotipi ed è anche abbastanza flessibile da supportare diversi materiali di substrato e per valutare diversi enzimi. Il metodo che utilizziamo prevede la formattazione del materiale vegetale sotto forma di polvere, che viene poi pretrattata con un acido diluito o alcalino a 90 gradi per 20 minuti. Successivamente, viene eseguita una digestione enzimatica utilizzando una miscela di cellulasi commerciale a 50 gradi per otto ore.

Infine, un metodo MBTH viene utilizzato per determinare il rilascio di zuccheri riducenti. Il materiale vegetale viene raccolto sotto forma di steli secchi, che vengono tagliati come segmenti di quattro millimetri. Questi vengono posti in fiale da due millilitri insieme a tre sfere di metallo da cinque millimetri.

Le fiale sono etichettate singolarmente con codici a barre, che vengono scansionati per garantire la tracciabilità dei campioni. I campioni vengono caricati nei robot di rettifica e formattazione nei robot. I campioni vengono macinati e miscelati automaticamente per consentire l'erogazione della biomassa in una piastra a 96 pozzetti.

Le fiale vengono forate, quindi la fiala viene riposizionata nel braccio robotico in modo che si trovi all'interno di un imbuto che vibra per erogare la polvere. La vibrazione dell'imbuto è regolata da un bilanciere per raggiungere la quantità target di massa per pozzo erogato. La biomassa viene erogata in 10 colonne di piastre, lasciando due colonne per gli standard.

Eseguendo quattro ripetizioni per campione, carichiamo 20 campioni per piastra. L'idrolizzato di questa piastra sarà triplicato in piastre PCR, ottenendo tre piastre ottiche. In questo modo, abbiamo tre determinazioni di zuccheri riducenti per pozzo di biomassa.

Una volta formattate, le lastre vengono sigillate con un tappetino in silicone per evitare l'evaporazione. Quando sono pronti, vengono spostati sul robot per la movimentazione dei liquidi. Nella manipolazione dei liquidi, il pretrattamento robotizzato, l'idrolisi enzimatica e la determinazione degli zuccheri rilasciati vengono eseguiti automaticamente.

Il tavolo da due metri è dotato di contenitori per i diversi reagenti necessari, nonché di spazio per lo stoccaggio della plastica. Sono presenti incubatori per il pretrattamento e l'idrolisi, nonché termociclatori per la determinazione dello zucchero. Il pretrattamento viene effettuato nella piastra a pozzetti profondi.

Aggiungendo soluzioni acide o alcaline diluite alla polvere di biomassa. Le piastre vengono trasferite nel blocco riscaldante e incubate a 90 gradi per 20 minuti. Al termine di questa incubazione, il pretrattamento viene rimosso risciacquando cinque volte con 500 microlitri di tampone di acetato.

Una volta risciacquato il pretrattamento, viene aggiunto un cocktail enzimatico. È una miscela standard. Contiene cellulosa, un novozima 1, 8 8 in un rapporto di quattro a uno come una concentrazione di sette FPU per pozzetto.

Le piastre vengono incubate per otto ore a 50 gradi durante l'agitazione. 75 microlitri dell'idrolizzato risultante vengono trasferiti in una piastra PCR. Nelle colonne 11 e 12 delle piastre PCR sono aggiunti gli standard di glucosio.

Successivamente, 25 microlitri di un molare di idrossido di sodio vengono aggiunti a tutti i pozzetti. Infine, 50 microlitri di reagente MBTH vengono pipettati nella piastra PCR. La piastra a pozzetti profondi viene conservata dopo il completamento del trasferimento dell'idrolizzato alla terza piastra PCR.

Mentre le piastre PCR vengono spostate nei termociclatori per l'incubazione a 60 gradi per 15 minuti. La fase finale del processo è il trasferimento della miscela di reazione su lastre ottiche per lo sviluppo del colore. Dopo l'incubazione, le piastre PCR vengono rimosse dal termociclatore.

Un centinaio di microlitri di reagente ossidante viene aggiunto alla miscela di reazione trasferita. Per facilitare lo sviluppo del colore, il processo di manipolazione del liquido viene eseguito quattro volte in 24 ore, dove il risciacquo pre-trattamento, un'aggiunta di enzima richiede circa due ore. L'idrolisi enzimatica dura otto ore e la determinazione dello zucchero richiede altre due ore.

Mentre la prima piastra è in incubazione per otto ore, la piastra successiva inizia il processo. Con questa allocazione delle risorse robotiche, si ottengono tre dosi di 80 campioni al giorno per determinare la quantità di zuccheri riducenti rilasciati. Le piastre ottiche hanno una temperatura nominale di 620 nanometri.

I risultati che si ottengono vengono analizzati per quantificare gli zuccheri rilasciati come nanomoli per milligrammo per ora di reazione. Quindi grazie per aver guardato, e spero che questo ispiri la vostra ricerca sui biocarburanti.