Name: High-throughput per lanalisi Saccarificazione materiali lignocellulosici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Scopri un metodo ad alto rendimento per analizzare la saccarificazione di biomassa lignocellulosica. Questa tecnica automatizzata valuta rapidamente il potenziale di rilascio degli zuccheri per applicazioni nei biocarburanti.

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Gli autori desiderano ringraziare A Viksø-Nielsen (Novozymes) per il dono degli enzimi cellulosolitici. Questo lavoro è stato finanziato dal 7 ° PQ RINNOVO e dai progetti BBSRC BB/G016178 e BB/G016194.

1. Preparazione dei campioni Di solito lavoro con steli da entrambi erbacee o piante legnose. Nel caso di materiali erbacee che crescono le piante a maturità, e dopo lo sviluppo di semi che raccogliamo steli secchi, una volta senescenza è completa. Gli steli sono tagliate in 4 segmenti mm e collocati in 2 flaconi ml con tre palle di fresatura. Nel caso di materiali legnosi, i campioni sono terreno di segatura grossolana con un file in legno corso e quindi posto in un mulino a sfere per ulteriori elaborazioni. I campioni sono posti in un rack all'interno della rettifica / formattazione stazione (Figura 1). Questa stazione macina in sequenza, si mescola e pesa ogni campione. Il numero di ripetizioni necessarie per campione è stabilita testando il materiale a terra in una serie di esperimenti preliminari in cui si determina la variabilità intrinseca di una certa dimensione delle particelle. Il 2 flaconi ml sono forate nella parte inferiore e materiali sono dispensati dalle vibrazioni del flaconcino il pozzetto selezionato. Il braccio vibrante è controllato da un feedback da parte l'equilibrio che consenta l'erogazione accurata della polvere. Il robot dispensa 4 mg / e in un'analisi standard e 4 ripetizioni sono necessari nella maggior parte dei casi. Ciò consente di 20 campioni vegetali / piastra da analizzare. 2. Pretrattamento Una volta che i campioni sono formattati, le piastre a 96 pozzetti vengono elaborati da un sistema automatizzato di gestione dei liquidi (Figura 2). Ecco un pretrattamento mite viene eseguita sul materiale vegetale con l'aggiunta di 350 ml di soluzioni acide o alcaline e il riscaldamento della piastra su un blocco adattato. Per evitare l'evaporazione durante l'analisi, il 96 pozzetti sono sigillati con silicone opaco. La temperatura e l'ora del pre-trattamento può essere modificato a seconda dei materiali oggetto di studio. La temperatura massima, comunque, è di 100 ° C. Una procedura alternativa per i test pre-trattamenti più dura è quella di pretrattare i materiali off line ed eliminare il pretreatmet dal processo. 3. Idrolisi <ol><li> Dopo che i materiali sono pretrattati, il robot rimuove automaticamente la soluzione di pretrattamento, e lavaggi, tutti i pozzi, 5 volte con 850 microlitri 25 mM tampone acetato. I risciacqui vengono effettuate con l'aggiunta di tampone alla soluzione pre-trattamento e, successivamente, la rimozione del 50% del volume totale dopo aver lasciato i solidi nel campione di stabilirsi. L'altezza della aspirazione è fissato a metà della massa liquida al fine di evitare l'aspirazione dei solidi dal fondo del pozzo, vi è la perdita trascurabile di solidi utilizzando questo approccio. Dopo questi lavaggi del pH nel pozzo è 4.5 e il materiale è pronto per idrolisi enzimatica. </li><li> Una miscela di enzimi che contiene una soluzione di cellulasi e emicellulasi viene aggiunto dal robot. In ciascun pozzetto, 850 ml di miscela di enzimi è erogato e la piastra viene spostato in un 50 ° C agitando incubatore. L'idrolisi standard viene eseguita per 8 ore, ma questa volta può essere adattata allo scopo dell'esperimento. Il carico enzima standard utilizzato per erbe FPU è di 7 / g di materiale. </li></ol> 4. Rilevamento di zuccheri riduttori Determinazione degli zuccheri riduttori rilasciato dopo idrolisi è stata effettuata utilizzando una versione modificata del 3-metil-2-benzotiazolinone hydrozone (MTBH) metodo 3. MBTH è stato selezionato come il metodo più adatto perché era il più facile da automatizzare e meno soggetti a interferenze da composti come le proteine. Abbiamo modificato questo metodo altamente sensibile per l'uso sulla piattaforma robotica in modo che possa quantificare con precisione gli zuccheri alle concentrazioni presenti in idrolizzati biomassa, con un volume finale di 250 microlitri che è adatto a uno standard ottico 96 pozzetti. Tutte le fasi di seguito vengono eseguite automaticamente e tre determinazioni indipendenti dalla zuccheri riducenti sono state effettuate per ogni reazione saccarificazione. <ol><li> 30 ml di idrolizzato è stato preso dal piatto profondo e ben miscelati con 45 ml di 25 mM tampone acetato di sodio in una minigonna PCR 96 pozzetti. </li><li> 25 ml di NaOH 1N e 50 ml di una soluzione contenente 0,43 mg / ml MBTH e 0,14 mg / ml DTT sono stati aggiunti. </li><li> Dopo la miscelazione, la piastra PCR è stata riscaldata a 60 ° C per 20 minuti in un termociclatore o un dispositivo simile che fornisce esattamente la stessa quantità di calore a tutti i 96 pozzetti. </li><li> La reazione che ne deriva è stato trasferito a una piastra ottica. </li><li> Aggiungere 100 ml di reagente ossidante (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% di acido solfammico e 0,1% di HCl). Mescolare bene e lasciare a sviluppare per almeno 1 h. </li><li> Ogni piatto dovrebbe contenere anche le reazioni standard di 50 nmol, 100 nmol e 150 nmol glucosio. Le piastre ottici vengono letti a 620 nm. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Esempi di diversi tipi di analisi sono presentati in figura 3 e 4. Tutti i risultati sono stati ottenuti utilizzando la piattaforma automatizzata. Figura 3 ripresenta l'aumento di zuccheri riduttori rilasciata da 8 incubazioni h da pioppo terra con quantità crescenti di enzimi cellulosolitici. La figura 4 presenta gli effetti di acidi e alcalini pretrattamento su campioni di pioppo. Il pretrattamento NaOH è più efficiente che il pretrattamento H2SO4 diluito nel facilitare il rilascio di zuccheri durante l'idrolisi. La quantità di zuccheri misurati dopo idrolisi diminuisce quando il pre-trattamento viene eseguito utilizzando le concentrazioni di NaOH superiore a 1M. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Stazione robotica per la macinazione e 96 e la formattazione delle biomasse <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Stazione di gestione dei liquidi per l'analisi ad alta saccarificazione Throughput <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Effetto di carichi diversi enzimi sul rilascio di equivalenti di riduzione zucchero da campioni di pioppo <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Effetto dei pre-trattamenti diversi sulla saccarificazione di campioni di pioppo. Zuccheri A. rilasciato dopo pretrattamento con diverse percentuali di H2SO4 a 90 ° C per 30 minuti. Zuccheri B. rilasciato dopo pretrattamenti NaOH alla stessa temperatura e il tempo che il pretrattamento acido .

<ol><li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Physiol+Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li>
<li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass%3A+the+writing%27s+on+the+walls%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li>
<li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li>
<li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li>
</ol>

Si possono utilizzare variazioni del protocollo standard di saccarificazione sulla stessa piattaforma per determinare l'attività di enzimi cellulolitici (ad esempio, variando le concentrazioni di enzima utilizzate in una piastra e impiegando la carta come substrato); confrontare l'efficienza di diverse miscele enzimatiche su un materiale specifico; analisi cinetica della saccarificazione; ecc.
Un protocollo standard di saccarificazione per confrontare il potenziale di saccarificazione in diversi materiali vegetali prevede un'idrolisi di otto ore (Figure 3 e 4). La maggior parte dei materiali vegetali analizzati richiede quattro ripetizioni. In queste condizioni, la piattaforma può elaborare 80 campioni/giorno. Questa analisi viene utilizzata per esaminare ampie popolazioni di orzo, mais e brachipodio al fine di stabilire la variabilità nel potenziale di saccarificazione e i geni coinvolti nella sua determinazione4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Macinazione e peso del robot </td><td> Labman Automation </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml micro tubo con tappi </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72,694 </td></tr><tr><td> 5 pedine mm in acciaio inox </td><td> Qiagen Ltd </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1,2 ml Abgene piazza pozzetti di stoccaggio </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TUL-050-050C </td></tr><tr><td> Whatman tappo tappetino per 96 piatti quadrati e </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> Hanling robot liquidi </td><td> Tecan Group Ltd. </td><td> Freedom Evo 200 </td></tr><tr><td> Acido solforico </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> Idrossido di sodio </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> BPE359-500 </td></tr><tr><td> Di sodio acetato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8750-500G </td></tr><tr><td> L&#39;acido acetico </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 pozzetti gonna PCR pieno </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3-metil-2-benzotiazolinone idrazone cloridrato idrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 129739-25G </td></tr><tr><td> DL-ditiotreitolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9163-1G </td></tr><tr><td> Corning micropiastre 96 pozzetti fondo piatto e </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TKT-521-050H </td></tr><tr><td> Ammonio ferro (III) solfato dodecaidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1668-250G </td></tr><tr><td> Sulfamic acido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 242772-500G </td></tr><tr><td> Acido cloridrico </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

high-throughput per l&#39;analisi saccarificazione materiali lignocellulosici

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polisaccaridi che costituiscono la biomassa lignocellulosica impianto può essere suddiviso per produrre una gamma di zuccheri che successivamente può essere utilizzato nella creazione di una bioraffineria. Queste materie prime costituirebbero una nuova piattaforma industriale, che sia sostenibile e carbon neutral, per sostituire l&#39;attuale dipendenza dai combustibili fossili. La riluttanza di decostruzione osservati in materiali lignocellulosici è prodotto da diverse proprietà intrinseche delle pareti delle cellule vegetali. Cellulosa cristallina è incorporato in matrice di polisaccaridi come xylans e arabinoxilani, e tutta la struttura è incassata dal fenolici lignina polimero, che è anche difficile da digerire 1. Al fine di migliorare la digeribilità dei materiali vegetali abbiamo bisogno di scoprire le principali strozzature per la saccarificazione delle pareti cellulari e anche mutanti schermo e popolazioni nidificanti di valutare la variabilità in saccarificazione 2. Queste attività richiedono un approccio un elevato throughput e qui vi presentiamo una piattaforma di analisi che possono effettuare analisi saccarificazione in un formato a 96 pozzetti della piastra. Questa piattaforma è stata sviluppata per consentire la proiezione di digeribilità lignocellulosa di grandi popolazioni di specie vegetali diverse. Abbiamo ridimensionato volumi di reazione per il pretrattamento dolce, parziale idrolisi enzimatica e determinazione lo zucchero, per consentire un gran numero di valutare rapidamente in un sistema automatizzato. Questa piattaforma automatizzata lavora con quantità dell&#39;ordine di milligrammi di biomassa, l&#39;esecuzione di fresatura palla in condizioni controllate per ridurre i materiali vegetali di una granulometria standardizzata in modo riproducibile. Una volta che i campioni sono a terra, il robot formattazione automatica dispensa determinata quantità di materiale e registrato nei pozzetti corrispondenti della piastra da 96 pozzi profondi (Figura 1). Normalmente, distribuire lo stesso materiale in 4 pozzi di avere 4 repliche per l&#39;analisi. Una volta che i piatti sono pieni di materiale vegetale nel layout desiderato, vengono spostati manualmente ad una stazione di manipolazione dei liquidi (Figura 2). In questa stazione i campioni sono sottoposti ad un pretrattamento mite sia con acido diluito o alcalini e incubate a temperature fino a 90 ° C. La soluzione di pretrattamento viene successivamente rimossa ed i campioni sono sciacquati con tampone per tornare ad un pH adatto per idrolisi. I campioni vengono quindi incubati con una miscela di enzimi per un periodo di tempo variabile a 50 ° C. Un&#39;aliquota è tratto dal idrolisati e gli zuccheri riduttori vengono automaticamente determinata con il metodo colorimetrico MBTH.

Un metodo semplice e rapido per determinare il potenziale saccarificazione di un gran numero di campioni di biomassa vegetale è descritto. La piattaforma automatizzata per questa analisi comporta la preparazione della biomassa vegetale per l&#39;analisi in 96 pozzetti e le prestazioni successive di pretrattamento, l&#39;idrolisi e la quantificazione degli zuccheri rilasciato.

High-throughput per l&#39;analisi Saccarificazione materiali lignocellulosici

I polisaccaridi che compongono la biomassa lignocellulosica vegetale possono essere degradati per produrre una gamma di zuccheri che possono essere successivamente utilizzati per stabilire...

Ciao, sono Kara Ted, io sono Leo. Vai, io. E io sono Simon McQueen Mason.La digeribilità della biomassa vegetale è un argomento di grande interesse attuale. Questo perché una grande quantità di zuccheri è legata ai polisaccaridi delle pareti cellulari vegetali che costituiscono tale biomassa, e se riusciamo a liberare questi zuccheri in forma utilizzabile, possiamo fermentarli per produrre svariati prodotti come carburanti e sostanze chimiche. Sfortunatamente, questi materiali sono estremamente difficili da digerire e ottenere una migliore comprensione dei fattori che ne controllano la digeribilità è una questione di una certa urgenza.Per poter utilizzare il materiale vegetale nella produzione di gruppi rinnovabili, dobbiamo essere in grado di misurare il potenziale di fificazione in queste piante. Qui all'Università di York, stiamo analizzando ampie popolazioni di materiale vegetale per determinarne il potenziale di fificazione. La fificazione è il processo mediante il quale i carboidrati complessi vengono scissi nelle loro componenti monosaccaridiche, producendo sostanze chimiche di valore attraverso diversi processi industriali.Per misurare il potenziale di fermentazione, riproduciamo processi industriali a livello microscopico, sottoponendo la biomassa a un pretrattamento e a un'idrolisi enzimatica per determinare gli zuccheri rilasciati. Questo permette di identificare varietà interessanti tra i genotipi. Il sistema ad alta produttività opera in un formato di piastra IG a sei pozzetti.Vengono utilizzate condizioni di idrolisi blande per evidenziare differenze sottili tra genotipi, e il metodo è sufficientemente flessibile da supportare diversi materiali di partenza, nonché da valutare diversi enzimi. Il metodo che utilizziamo prevede la preparazione del materiale vegetale sotto forma di polvere, che viene quindi pretrattata con un acido o una base diluiti a 90 gradi per 20 minuti. Successivamente, viene effettuata una digestione enzimatica utilizzando una miscela commerciale di cellulasi a 50 gradi per otto ore.Infine, si utilizza un metodo MBTH per determinare il rilascio di zuccheri riducenti. Il materiale vegetale viene raccolto sotto forma di fusti secchi, che vengono tagliati in segmenti di quattro millimetri. Questi vengono inseriti in vial da due millilitri insieme a tre sfere metalliche da cinque millimetri.I vialli sono etichettati singolarmente con codici a barre, che vengono scansionati per garantire la tracciabilità dei campioni. I campioni vengono caricati nei robot di macinazione e formattazione all'interno dei robot. I campioni vengono macinati e mescolati automaticamente per consentire l'allestimento della biomassa in una piastra a 96 pozzetti.I vial vengono perforati, quindi il vial viene riposizionato nel braccio robotico in modo da trovarsi all'interno di un imbuto che vibra per dispensare la polvere. La vibrazione dell'imbuto è regolata mediante una bilancia per raggiungere la quantità desiderata in massa per pozzetto dispensata. La biomassa viene dispensata in 10 colonne delle piastre, lasciando due colonne per gli standard.Eseguendo quattro ripetizioni per campione, carichiamo 20 campioni per piastra. L'idrolizzato di questa piastra verrà triplicato in piastre per PCR, ottenendo tre piastre ottiche. In questo modo, abbiamo tre determinazioni di zuccheri riducenti per ogni pozzetto di biomassa.Dopo la preparazione, le piastre vengono sigillate con un tappetino di silicone per evitare l'evaporazione. Quando sono pronte, vengono trasferite al robot per la manipolazione dei liquidi. Nel robot per la manipolazione dei liquidi, il pretrattamento, l'idrolisi enzimatica e la determinazione degli zuccheri rilasciati vengono eseguiti automaticamente.Il tavolo di due metri dispone di contenitori per i diversi reagenti necessari, nonché di spazio di stoccaggio per la plastica. Sono presenti incubatori per la pretrattamento e l'idrolisi, oltre a termociclatori per la determinazione degli zuccheri. Il pretrattamento viene effettuato nella piastra a pozzetti profondi.Aggiungendo soluzioni diluite acide o alcaline alla polvere di biomassa. Le piastre vengono trasferite sul blocco riscaldante e incubate a 90 gradi per 20 minuti. Al termine di questa incubazione, il pretrattamento viene rimosso lavando cinque volte con 500 microlitri di tampone acetato.Dopo il risciacquo del pretrattamento, viene aggiunta una miscela enzimatica. Si tratta di una miscela standard che contiene cellulasi e un novozima 1, 8 8 in un rapporto di quattro a uno, con una concentrazione di sette FPU per pozzetto.Le piastre sono incubate per otto ore a 50 gradi sotto agitazione. 75 microlitri dell'idrolizzato risultante vengono trasferiti in una piastra PCR. Nelle colonne 11 e 12 delle piastre PCR vengono aggiunti gli standard di glucosio.Successivamente, 25 microlitri di idrossido di sodio uno molare vengono aggiunti in tutti i pozzetti. Infine, 50 microlitri di reagente MBTH vengono prelevati con una pipetta e trasferiti nella piastra PCR. La piastra con pozzetti profondi viene conservata dopo il completamento del trasferimento dell'idrolizzato nella terza piastra PCR.Mentre le piastre per PCR vengono trasferite nei termociclatori per l'incubazione a 60 gradi per 15 minuti. L'ultimo passaggio del processo è il trasferimento della miscela di reazione in piastre ottiche per lo sviluppo del colore. Al termine dell'incubazione, le piastre per PCR vengono rimosse dal termociclatore.Si aggiungono 100 microlitri di reagente ossidante alla miscela di reazione trasferita. Per favorire lo sviluppo del colore, il processo di manipolazione del liquido viene eseguito quattro volte nell'arco di 24 ore, in cui il risciacquo preliminare e l'aggiunta dell'enzima richiedono circa due ore. L'idrolisi enzimatica dura otto ore, mentre la determinazione degli zuccheri richiede altre due ore.Mentre la prima piastra è in incubazione per otto ore, la piastra successiva inizia il processo. Con questa allocazione delle risorse robotiche, si ottiene una produzione tripla di 80 campioni al giorno per determinare la quantità di zuccheri riducenti rilasciati. Le piastre ottiche vengono lette a 620 nanometri.I risultati ottenuti vengono analizzati per quantificare gli zuccheri rilasciati in nanomoli per milligrammo per ora di reazione. Grazie quindi per aver guardato il video e spero che questo possa ispirare la vostra ricerca nei biocarburanti.

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