High-throughput per l'analisi Saccarificazione materiali lignocellulosici

Ciao, sono Kara Ted, io sono Leo. Vai, io. E io sono Simon McQueen Mason.

La digeribilità della biomassa vegetale è un argomento di grande interesse attuale. Questo perché vi è una notevole quantità di zuccheri legati ai polisaccaridi delle pareti cellulari vegetali che costituiscono tale biomassa, e se riusciamo a liberare questi zuccheri in una forma utilizzabile, possiamo fermentarli per produrre svariati composti, come carburanti e sostanze chimiche. Purtroppo, questi materiali sono estremamente difficili da digerire e ottenere una migliore comprensione dei fattori che ne controllano la digeribilità è una questione di una certa urgenza.

Per poter utilizzare il materiale vegetale nella produzione di gruppi rinnovabili, dobbiamo essere in grado di misurare il potenziale di fificazione in queste piante. Qui all'Università di York, stiamo analizzando ampie popolazioni di materiale vegetale per determinarne il potenziale di fificazione. La fificazione è il processo mediante il quale i carboidrati complessi vengono scissi nelle loro componenti monosaccaridiche per produrre sostanze chimiche di valore attraverso diversi processi industriali.

Per misurare il potenziale di fermentazione, riproduciamo processi industriali a livello microscopico, sottoponendo la biomassa a un pretrattamento e a un'idrolisi enzimatica per determinare gli zuccheri rilasciati. Questo permette di identificare varietà interessanti tra i genotipi. Il sistema ad alta produttività opera in un formato di piastra IG a sei pozzetti.

Condizioni di idrolisi lievi vengono utilizzate per evidenziare differenze sottili tra genotipi, e il metodo è sufficientemente flessibile da consentire l'uso di diversi materiali di partenza nonché la valutazione di diversi enzimi. Il metodo che utilizziamo prevede la preparazione del materiale vegetale sotto forma di polvere, che viene quindi sottoposta a un pretrattamento con un acido o una base diluiti a 90 gradi per 20 minuti. Successivamente, si esegue una digestione enzimatica mediante una miscela commerciale di cellulasi a 50 gradi per otto ore.

Infine, si utilizza un metodo MBTH per determinare il rilascio di zuccheri riducenti. Il materiale vegetale viene raccolto sotto forma di fusti secchi, che vengono tagliati in segmenti di quattro millimetri. Questi vengono inseriti in vial da due millilitri insieme a tre sfere metalliche da cinque millimetri.

I vialli sono etichettati singolarmente con codici a barre, che vengono scansionati per garantire la tracciabilità dei campioni. I campioni vengono caricati nei robot di macinazione e formattazione all'interno dei robot. I campioni vengono macinati e mescolati automaticamente per consentire l'allestimento della biomassa in una piastra a 96 pozzetti.

I flaconcini vengono perforati, quindi il flaconcino viene riposizionato nel braccio robotico in modo da trovarsi all'interno di un imbuto che vibra per erogare la polvere. La vibrazione dell'imbuto è regolata mediante una bilancia per raggiungere la quantità desiderata in massa per pozzetto erogata. La biomassa viene dispensata in 10 colonne delle piastre, lasciando due colonne per gli standard.

Eseguendo quattro ripetizioni per campione, carichiamo 20 campioni per piastra. L'idrolizzato di questa piastra verrà triplicato in piastre per PCR, ottenendo tre piastre ottiche. In questo modo, abbiamo tre determinazioni di zuccheri riducenti per ogni pozzetto di biomassa.

Dopo la preparazione, le piastre vengono sigillate con un tappetino di silicone per evitare l'evaporazione. Quando sono pronte, vengono trasferite al robot per la manipolazione dei liquidi. Nel robot per la manipolazione dei liquidi, il pretrattamento, l'idrolisi enzimatica e la determinazione degli zuccheri rilasciati vengono eseguiti automaticamente.

Il tavolo di due metri dispone di contenitori per i diversi reagenti necessari, nonché di spazio di stoccaggio per le plastichine. Sono presenti incubatori per la pretrattamento e l'idrolisi, oltre a termociclatori per la determinazione degli zuccheri. Il pretrattamento viene effettuato nella piastra a pozzetti profondi.

Aggiungendo soluzioni diluite acide o alcaline alla polvere di biomassa. Le piastre vengono trasferite sul blocco riscaldante e incubate a 90 gradi per 20 minuti. Al termine di questa incubazione, il pretrattamento viene rimosso lavando cinque volte con 500 microlitri di tampone acetato.

Dopo aver risciacquato il pretrattamento, si aggiunge un cocktail enzimatico. Si tratta di una miscela standard che contiene cellulasi e un novozima 1, 8 8 in rapporto quattro a uno, con una concentrazione di sette FPU per pozzetto.

Le piastre vengono incubate per otto ore a 50 gradi sotto agitazione. 75 microlitri dell'idrolizzato risultante vengono trasferiti in una piastra PCR. Nelle colonne 11 e 12 delle piastre PCR vengono aggiunti gli standard di glucosio.

Successivamente, 25 microlitri di idrossido di sodio uno molare vengono aggiunti in tutti i pozzetti. Infine, 50 microlitri di reagente MBTH vengono prelevati con una pipetta e trasferiti nella piastra PCR. La piastra con pozzetti profondi viene conservata dopo il completamento del trasferimento dell'idrolizzato nella terza piastra PCR.

Mentre le piastre per PCR vengono trasferite nei termociclatori per l'incubazione a 60 gradi per 15 minuti. L'ultimo passaggio del processo è il trasferimento della miscela di reazione in piastre ottiche per lo sviluppo del colore. Al termine dell'incubazione, le piastre per PCR vengono rimosse dal termociclatore.

Si aggiungono 100 microlitri di reagente ossidante alla miscela di reazione trasferita. Per favorire lo sviluppo del colore, il processo di manipolazione del liquido viene eseguito quattro volte nell'arco di 24 ore, in cui il risciacquo preliminare e l'aggiunta dell'enzima richiedono circa due ore. L'idrolisi enzimatica richiede otto ore e la determinazione degli zuccheri richiede altre due ore.

Mentre la prima piastra è in incubazione per otto ore, la piastra successiva inizia il processo. Con questa allocazione delle risorse del robot, si ottiene una produzione tripla di 80 campioni al giorno per determinare la quantità di zuccheri riducenti rilasciati. Le piastre ottiche vengono lette a 620 nanometri.

I risultati ottenuti vengono analizzati per quantificare gli zuccheri rilasciati in nanomoli per milligrammo per ora di reazione. Grazie quindi per aver guardato il video e spero che questo possa ispirare la vostra ricerca nei biocarburanti.