Name: Lintroduzione di shear stress nello studio di adesione batterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Scopri come studiare l'adesione batterica sotto stress di taglio usando camere a flusso e cellule endoteliali. Questo metodo permette di analizzare la colonizzazione batterica in condizioni fisiologiche realistiche.

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Gli autori desiderano ringraziare Emilie Mairey e Emmanuel Donnadieu per il primo insediamento della procedura.

1. Della cellula ospite umano e coltura batterica <ol><li> HUVECs cultura passaggio tra 1 e 9 a 37 ° in un incubatore umidificato con il 5% (v / v) di CO 2. Passaggio delle cellule quando si avvicinano l'80% confluenza con tripsina / EDTA per fornire culture manutenzione su 75 cm 2 fiaschi cultura e delle culture sperimentali in camere a flusso monouso (μ-Slides VI). </li><li> Ritirare media dai contenitori da diversi passaggi, lavare le cellule con 10 ml di PBS, ritirare e sostituirlo con 1,5 ml di tripsina / EDTA. Permettono alle cellule di staccare in una coltura cellulare incubatore per 5 minuti a 37 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule con 10 ml di mezzo di coltura cellulare in una provetta da 15 ml di raccolta. Agglomerare le cellule con una centrifugazione 5 minuti (a 200 g), a temperatura ambiente. Sospendere le cellule in 4 ml di Endo-SFM supplementato con 10% (v / v) di FBS e contare su una camera di Malassez, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Introdurre 30 ml di uno 1x10 6 cellule HUVEC per ml di sospensione nel canale (3x10 4 in totale) e permettono alle cellule di aderire per 3 ore a 37 ° in un incubatore umidificato con un'atmosfera del 5% (v / v) di CO 2. Aggiungere un volume aggiuntivo di 120 ml di Endo-SFM a riempire i pozzi. Le cellule dovrebbero formare un monostrato subconfluent (Figura 2). </li><li> Crescere N. meningitidis che esprimono GFP (in questo caso ceppo 8013 GFP che esprimono sotto il controllo di un IPTG-inducibile promotore), su piastre di agar GCB contenente Kellogg integratori e 5 mg / ml di cloramfenicolo a 37 ° C in atmosfera umida contenente il 5% (v / v) di CO 2 per 16 ore. </li></ol> 2. Adesione iniziale di batteri individuali di ospitare le cellule <ol><li> Regolare la concentrazione di batteri coltivati ​​su piastre di agar GCB ad un OD600 di 0,05 con pre-riscaldato Endo-SFM contenente il 10% (v / v) di FBS e incubare per 120 minuti a 37 ° C in atmosfera umida contenente il 5% (v / v) di CO 2, in agitando delicatamente (130 giri). Indurre l'espressione GFP con l'aggiunta di 1 mM IPTG nel terreno di coltura per l'intero periodo di incubazione. </li><li> Posizionare la usa e getta μ-Slide sul palcoscenico di un microscopio invertito dotato di una piattaforma riscaldata per mantenere la temperatura del campione a 37 ° C. </li><li> Versare preriscaldata Endo-SFM integrato con il 2% (v / v) FBS in un bicchiere di vetro sterile e riempire una siringa sterile da 50 ml con questo mezzo. Collegare il tubo "voce" alla siringa e riempire con l'introduzione di mezzo. </li><li> Collegare il tubo "voce" al μ-Slide, con cura, al fine di evitare l'introduzione di aria nella camera. Poi, apporre il tubo "uscita" verso l'altra estremità e compilare accuratamente il canale con medie di circa 1 cm di distanza dalla "uscita" da camera. </li><li> Misurare la OD600 batterica e regolare a 0,15 in Endo-SFM contenente il 2% (v / v) di FBS. Per guardare i batteri individuale qualsiasi aggregati deve essere interrotto da vortex vigorosa del campione batterica. </li><li> Posto 100 l di Endo-SFM integrato con il 2% (v / v) FBS medio nel serbatoio e aggiungere 100 microlitri della soluzione batterica presa dalla cima della soluzione in agitazione per evitare di campionamento ogni aggregati rimanenti batterica. </li><li> Con attenzione introdurre il volume di 200 microlitri nel μ-Slide girando il rubinetto per iniettare i batteri nella camera. </li><li> Introdurre Endo-SFM contenente il 2% (v / v) di FBS, mantenuto a 37 ° C con la piattaforma riscaldata, nella camera usando una pompa a siringa con un sforzo di taglio compatibile con l'adesione del 0,044 dyne / cm 2 per 15 minuti. </li></ol> Vedere il video per 1 o esempio la figura 3. Dopo questo passaggio, spostare le sezioni 3, 4 o 6. 3. Quantificazione di adesione iniziale di batteri individuali per le cellule ospiti <ol><li> Dopo l'adesione iniziale per 15 minuti, acquisire immagini di dieci campi in modo casuale mentre il liquido è ancora in circolazione. </li><li> Analizzare le immagini acquisite utilizzando il software ImageJ 8, al fine di accedere al numero medio di batteri adherant per campo. Questo avviene nel seguente modo: prima di tutto, ogni immagine è thresholded utilizzando la finestra "Soglia" che si trova nel menu "Immagine" per evidenziare i singoli batteri aderiscono fluorescenti, riducendo al minimo lo sfondo dalle cellule. Poi, ogni singolo batterio viene conteggiato, utilizzando il plug-in "Counter Cell" ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). I dati per ogni immagine sono riportate in un foglio di calcolo Excel e viene calcolata la media di quantificare il numero medio di batteri aderenti per campo. </li></ol> 4. Misurare la resistenza al flusso dei batteri singoli aderenti a cellule ospiti <ol><li> Programmare il siringa pompa set-up per generare sollecitazioni di taglio che vanno dal 3-100 dyne / cm 2 per 5 minuti. </li><li> Al termine dei 5 minuti, acquisire dieci campi scelti a caso come descritto al punto 3.1, ma con il flusso interrotto prIOR per l'acquisizione. </li><li> Analizzare le immagini acquisite come descritto al punto 3.2 e quantificare il numero medio di batteri rimasti per campo. </li></ol> 5. Misurare la crescita di un batterio isolato aderente ad un microcolony <ol><li> Introdurre Endo-SFM contenente il 10% (v / v) di FBS, mantenuto a 37 ° C con la piattaforma riscaldata, nella camera usando una pompa a siringa con lo stress di taglio scelto per diverse ore. Registrare le immagini in tempo reale la microscopia video un fotogramma ogni 5 minuti. </li><li> A seguito di microscopia video, fermare la sollecitazione di taglio, spegnendo la pompa a siringa, acquisire 2-3 immagini aggiuntive e quindi interrompere la sequenza di acquisizione delle immagini sul software. Un esempio di proliferazione batterica può essere visto sul video 2. </li></ol> 6. Misurare la resistenza al flusso di aderenti microcolonie batterica <ol><li> Dopo la formazione di grandi microcolonie sulla superficie cellulare (step5.2) 2-3 acquisire immagini di entrambe le cellule (per contrasto di fase) e batteri (da GFP-fluorescenza) prima dell'applicazione di flusso. Per il resto dell'esperimento, il protocollo di acquisizione monitorare solo la fluorescenza. </li><li> L'applicazione di elevate sollecitazioni di taglio per 5 minuti (300-100 dyne / cm 2) e registrare le immagini ad un frame ogni 5 secondi. </li><li> Interrompere la tensione di taglio, spegnendo la pompa a siringa, acquisire 2-3 immagini aggiuntive e quindi interrompere la sequenza di acquisizione delle immagini sul software. </li><li> Quindi, rimuovere il tubo di "uscita" prima e con attenzione, per evitare lo svuotamento del canale e quindi aggiungere preriscaldato mezzo fresco di riempire i pozzi prima di rimuovere il tubo "voce". </li><li> Per determinare quantitativamente l'effetto della sollecitazione di taglio sulla resistenza dei batteri, un saggio di placcatura può essere eseguita come segue: raccogliere i media residua e lavare la μ-Slide due volte con 120 ml di PBS, che rimuove il medium rimanenti dal canale (entrambi i lavaggi sono ) anche raccolti. </li><li> Staccare le cellule infettate con l'aggiunta di 50 ml di tripsina / EDTA per 5 minuti a 37 ° e mescolare il campione staccato con la sospensione raccolti nel passaggio precedente. </li><li> Effettuare diluizioni seriali in PBS e piastra a 10 microlitri frazione su piastre di agar GCB, in triplice copia, al fine di determinare il numero di unità formanti colonia (CFU) il giorno seguente, dopo incubazione delle piastre a 37 ° C in un incubatore con 5% (v / v) di CO 2. </li></ol> Video 3 e 4 confrontare il ceppo wild type con il mutante pilV. 7. Distacco batterica microcolonie <ol><li> Infettare le cellule nella camera di flusso ripetendo i punti da 2.1 a 2.8 e permettere l'infezione procede per 30 minuti. </li><li> Rimuovere i batteri non legato aumentando il flusso a 10 dyne / cm 2 per un periodo di 2 minuti e lasciare infezione proseguire per 2 ore. </li><li> Ridurre il flusso a 0,15 dyne / cm 2. </li><li> Ogni ora, raccogliere una goccia di media uscendo dalla camera di flusso. </li><li> Effettuare diluizioni seriali dei campioni e la piastra di loro su piastre di agar GCB. </li><li> Determinare il numero di unità formanti colonia (CFU) il giorno seguente, dopo incubazione delle piastre a 37 ° C in un incubatore con il 5% (v / v) di CO 2. </li></ol> 8. Rappresentante risultati <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: fasi differenti di un monostrato cellulare che può essere osservato e misurato in presenza di flusso della procedura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: monostrato di cellule endoteliali nella camera di flusso all'inizio di un esperimento (assenza di sforzo di taglio). Circa 50 le cellule endoteliali sono organizzati in una sub-confluenti monostrato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Rappresentazione grafica di adesione iniziale dei batteri sulla superficie cellulare. Valori per i tre campi sono indicati per dare un'idea del campo a campo di variazione che si prevede (0044 dyne / cm 2). Video 1. Visualizzazione di adesione iniziale di batteri sulla monostrato cellulare in funzione del tempo (0044 dyne / cm 2). GFP-esprimere i batteri stanno seguendo la direzione del flusso del fluido. Il film è accelerato 60 volte, la durata reale del video è di 10 minuti. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Clicca qui per vedere il video.</a> Video 2. Dopo i batteri adesione iniziale è stato permesso di proliferare sulla superficie cellulare, per un periodo di 7 ore (accelerato 1000-fold). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Clicca qui per vedere il video.</a> Video 3. Dopo proliferazione sulla superficie cellulare il meccanicoresistenza al di microcolonie è stato testato aumentando il livello di sollecitazione di taglio a 10 dyne / cm 2 per 5 minuti, ma microcolonie wild-type sono resistenti accelerato di 60 volte. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Clicca qui per vedere il video.</a> Microcolonie video 4. Formata dal mutante pilV sono interrotti da aumentare il flusso (10 dyne / cm 2). Questo mutante non riesce a indurre il rimodellamento della membrana plasmatica in microcolonie ed è quindi molto più sensibile alle sollecitazioni di taglio maggiore (il video è accelerato di 60 volte) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Clicca qui per vedere il video.</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;importanza della sollecitazione di taglio e, in generale degli aspetti meccanici in biologia è sempre più riconosciuto. Per esempio le proprietà altamente adattato adesivo della famiglia selectina di proteine ​​nel processo di adesione dei linfociti e rotolare sulla parete vascolare è stato riconosciuto con l&#39;introduzione di shear stress nel processo. La procedura sopra descritta è stata applicata al batteri Gram-negativi Neisseria meningitidis, ma dovrebbe essere applicabile a una vasta gamma di agenti patogeni. L&#39;importanza della sollecitazione di taglio è stato dimostrato anche per altri patogeni e altri siti di infezione. Adesione batterica condizionata da shear stress è stato descritto dallo studio del adesina FimH trovato su Escherichia coli uropatogeni (UPEC) 9. Simile a selectine, l&#39;interazione tra FimH e del suo recettore della cellula ospite ha dimostrato di essere rafforzata da forze meccaniche di taglio indotta 9 e il adesina CfaE di enterotossigena E.coli è stata segnalata anche a mediare l&#39;adesione a cellule epiteliali intestinali attraverso un taglio-dipendente meccanismo 10. Abbiamo segnalato, con il flusso laminare protocollo del saggio camera descritto in questo capitolo che Streptococcus agalactiae pili erano essenziali per il rispetto di questo patogeno alle cellule epiteliali in condizioni di flusso 11. Questi studi confermano che il nostro saggio camera di flusso è uno strumento utile per lo studio della cellula ospite-patogeno interazioni in condizioni di stress di taglio.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0,4 kit di flusso </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Plastipak siringa da 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tubo Tygon R3603 3,2 x 4,8 millimetri </td><td> Fisher-Scientifico </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Rubinetto a 3 vie, 2 luer femmina a maschio luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Pompa siringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Microscopio invertito, Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD o ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> NIH </td><td> Gratuito ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

l&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Durante le infezioni batteriche una sequenza di interazioni avvengono tra il patogeno e il suo ospite. Adesione batterica alla superficie della cellula ospite è spesso il primo passo e la determinazione della patogenesi. Anche se in via sperimentale l&#39;adesione è per lo più studiati in condizioni statiche adesione avviene concretamente in presenza di liquido che scorre. Primi incontri tra batteri e il loro ospite spesso si verificano a livello delle mucose, bocca, polmoni, intestino, occhio, ecc muco dove scorre lungo la superficie delle cellule epiteliali. Più tardi, nel infezione, agenti patogeni di tanto in tanto l&#39;accesso la circolazione del sangue che causano malattie letali come la setticemia, sepsi e meningite. Una caratteristica essenziale di queste infezioni è la capacità di questi patogeni di interagire con le cellule endoteliali in presenza di sangue circolante. La presenza di liquido che scorre, muco o di sangue, per esempio, determina l&#39;adesione perché genera una forza meccanica sul patogeno. Per caratterizzare l&#39;effetto di un liquido che scorre di solito si riferisce alla nozione di sforzo di taglio, che è la forza tangenziale per unità di superficie esercitata da un fluido in movimento vicino ad una parete fissa, espressa in dyne / cm 2. Intensità di sforzo di taglio variano ampiamente a seconda del tipo diversi vasi, le dimensioni, organo, posizione ecc (0-100 dyne / cm 2). Circolazione nei capillari può raggiungere valori molto bassi shear stress e anche interrompere temporaneamente durante i periodi che vanno da pochi secondi a diversi minuti 1. All&#39;altra estremità dello spettro di sollecitazione di taglio nelle arteriole può raggiungere i 100 dyne / cm 2 2. L&#39;impatto dello stress di taglio sui diversi processi biologici è stato chiaramente dimostrato come ad esempio durante l&#39;interazione dei leucociti con l&#39;endotelio 3. Per tenere conto di questo parametro meccanico nel processo di adesione batterica abbiamo approfittato di una procedura sperimentale basata sull&#39;utilizzo di un flusso monouso camera 4. Cellule ospiti sono coltivate in camera di flusso e batteri fluorescenti vengono introdotti nel flusso controllato da una pompa a siringa. Inizialmente abbiamo concentrato le nostre indagini sul patogeno batterico Neisseria meningitidis, un batterio Gram-negativo responsabile della setticemia e la meningite. La procedura descritta qui ci ha permesso di studiare l&#39;impatto dello stress di taglio sulla capacità dei batteri di: aderire alle cellule 1, a proliferare sulla superficie cellulare 5 e di staccare di colonizzare nuovi siti 6 (Figura 1). Complementare informazioni tecniche si trovano in riferimento 7. Valori di shear stress qui presentate sono state scelte in base alle nostre esperienze precedenti 1 e per rappresentare i valori trovati in letteratura. Il protocollo dovrebbe essere applicabile a una vasta gamma di agenti patogeni con aggiustamenti specifici a seconda degli obiettivi dello studio.

Durante il processo di infezione, un passo fondamentale è l&#39;adesione di patogeni con cellule ospiti. Nella maggior parte dei casi questo passo adesione avviene in presenza di sollecitazioni meccaniche generate dal flusso liquido. Descriviamo una tecnica che introduce sforzo di taglio come un parametro importante nello studio della adesione batterica.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

Durante le infezioni batteriche si verifica una sequenza di interazioni tra il patogeno e l'ospite. L'adesione batterica alla superficie della cellula ospite è spesso il...

Questo video illustra una procedura per lo studio degli effetti dello stress di taglio sull'adesione batterica. Durante un'infezione grave causata da un patogeno batterico come nice sirium mens, il patogeno raggiunge il flusso sanguigno, dove si attacca e colonizza le cellule dell'ospite subendo uno stress meccanico dovuto al flusso ematico; dopo la proliferazione, alcuni batteri si staccano e colonizzano nuovi siti, e il ciclo ricomincia. Per studiare i fattori che influenzano l'adesione batterica alle cellule dell'ospite, vengono introdotte cellule endoteliali in camere di flusso monouso e coltivate fino al raggiungimento della confluenza.Si aggiungono batteri fluorescenti e lo stress di taglio viene controllato sperimentalmente. Utilizzando una pompa per siringa, l'adesione dei batteri alle cellule ospiti e la loro proliferazione vengono seguite al microscopio. I video risultanti vengono analizzati per determinare l'effetto dello stress di taglio sul processo di colonizzazione dell'endotelio.Questa procedura può essere molto utile per lo studio della patogenesi della meningite da *Neisseria meningitidis*, ma può anche essere utilizzata per altri batteri sottoposti a stress di taglio durante il processo patogenetico. Questa tecnica, può risultare un po' complicata da eseguire, in particolare quando si tratta di introdurre bolle nel sistema, il che può rappresentare un problema. Oggi, a dimostrare la procedura sarà Mega, una studentessa di dottorato che lavora nel mio laboratorio.Gli esperimenti descritti in questo video vengono eseguiti utilizzando cellule coltivate in una microcamera IDI da sei 0,4, costituita da una camera di plastica sterile monouso contenente sei canali lunghi 17 millimetri e larghi 3,8 millimetri, con una profondità di 0,4 millimetri. Ogni canale dispone di due porte di accesso con adattatori a siringa, una per ciascuna estremità, per introdurre le cellule UVE. Pipettare 30 microlitri di una sospensione cellulare a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule in ciascuno dei canali della camera. Lasciare aderire le cellule per tre ore a 37 gradi in un incubatore umidificato con un’atmosfera di 5% CO₂.Dopo l'incubazione, aggiungere ulteriori 120 microlitri di endo SFM. Le cellule dovrebbero formare un monolayer subconfluente dopo circa 20 ore. Nel frattempo, effettuare un'isolazione su colture di GFP esprimente nice sirium meningitis su APLs; il batterio è un patogeno umano.Pertanto, ogni manipolazione di questo microrganismo deve essere eseguita in un impianto di sicurezza di livello due, con personale addestrato che indossi camice e guanti; si raccomanda la vaccinazione del personale contro il sierogruppo utilizzato. Ecco il ceppo 8 0 1 3. L'espressione di GFP viene coltivata sotto il controllo di una linea pura con promotore inducibile da IPDG.I batteri su piastre GC BPL contenenti integratori Kellogg e cinque microgrammi per millilitro di cloramfenicolo in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di CO₂ per 16 ore. Una volta stabilite le colture di cellule mammifere, i batteri vengono aggiunti alle cellule ospiti nel canale. In preparazione al saggio di flusso, utilizzando un’ansa da inoculo, raccogliere i batteri dalla piastra di Petri e trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri contenente terreno per colture cellulari endoteliali pre-riscaldate e integrate.Mezzo Endo SFM. Regolare la densità ottica a un OD 600 di 0,05 diluendo il campione nello stesso mezzo fino a un volume finale di cinque millilitri. Per indurre l'espressione di GFP, aggiungere IPTG a una concentrazione finale di un millimolare e incubare la coltura per 120 minuti.In un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 con agitazione delicata. Posizionare la microvetrina con le cellule endoteliali coltivate preparate in precedenza sulla piastra di un microscopio invertito dotato di piattaforma riscaldata per mantenere la temperatura del campione a 37 gradi Celsius. Versare l'endo SFM preriscaldato integrato con 2% di FBS in un altoparlante sterile di vetro e riempire la siringa da 50 millilitri tirando lo stantuffo.Il tubo di entrata è collegato a un rubinetto a tre vie. Successivamente, collegare il tubo di entrata alla siringa e premere lo stantuffo per riempire il tubo con il mezzo. Collegare con attenzione l'altra estremità del tubo di entrata alla microcamera utilizzando i connettori ad angolo retto forniti.Evitare l'introduzione di aria nella camera. Posizionare la siringa sulla pompa, quindi posizionare una siringa da un millilitro tagliata sull'attacco a tre vie disponibile come serbatoio. Successivamente, fissare il tubo di uscita all'altro estremo del canale e riempire con attenzione il canale con il mezzo spingendo lo stantuffo della siringa fino a una distanza di circa un centimetro dall'uscita della camera.Misurare l'OD batterico a 600 nm e aggiustare a 0,15 il mezzo SFM contenente il 2% di FBS, agitando vigorosamente il campione per rompere gli aggregati batterici. Successivamente, utilizzando una pipetta Pasteur in plastica monouso, trasferire 100 microlitri di mezzo endos FM integrato con FBS al 2% nel serbatoio. Quindi aspirare 100 microlitri della soluzione batterica dalla parte superiore della soluzione vorticata e aggiungerli al serbatoio.Ruotare con attenzione il rubinetto, iniettare i batteri nella camera del microscopio per permettere l'adesione in presenza di un livello controllato di stress di taglio. Introdurre il mezzo SFM endo contenente il 2% di FBS nella camera utilizzando la pompa a siringa a una velocità di 3,5 millilitri all'ora per 15 minuti. Questo video è accelerato di 60 volte.La durata effettiva è di 10 minuti. Dopo questo passaggio, l'adesione e il distacco dei batteri alle cellule ospiti in diverse condizioni possono essere valutati, come descritto nelle prossime sezioni del video. Per quantificare l'adesione iniziale di singoli batteri alle cellule ospiti, iniziare ad acquisire immagini dopo 15 minuti di flusso, mentre il liquido è ancora in circolazione; acquisire immagini di 10 campi casuali per determinare il numero medio di batteri aderenti per campo osservato.Aprire innanzitutto il software ImageJ e aprire l'immagine da analizzare. Iniziare facendo clic sul menu immagine e selezionando. Regolare il contrasto e la luminosità.Ottimizzare la visualizzazione dei singoli batteri aderenti fluorescenti rispetto allo sfondo regolando i livelli di intensità spostando il cursore. Quindi, nel plugin, analizzare il menu contatore di cellule. Aprire lo strumento contatore di cellule, inizializzare l'immagine, scegliere l'oggetto, il tipo e fare clic su ciascun batterio singolarmente.Il numero totale di batteri appare nella finestra. Infine, esportare i dati per ogni immagine su Excel ed eseguire una media per quantificare il numero medio di batteri aderenti per campo al fine di misurare la resistenza dei singoli batteri aderenti al flusso. Dopo i primi 15 minuti del programma di flusso, la pompa per siringa viene impostata per generare uno sforzo di taglio compreso tra tre e 100 dine per centimetro quadrato per cinque minuti.Al termine dei cinque minuti, arrestare il flusso e acquisire e analizzare 10 campi casuali come in precedenza per determinare il numero medio di batteri rimanenti per campo. Dopo i primi 15 minuti di flusso, regolare la pompa a siringa al valore di shear stress selezionato. Lasciare scorrere per diverse ore, registrando immagini a una frequenza di un fotogramma ogni cinque minuti.È consigliabile seguire diverse posizioni, qualora il microscopio sia dotato di una piattaforma motorizzata XY. Al termine della microscopia in tempo reale, interrompere lo stress di taglio spegnendo la pompa a siringa. Acquisire immediatamente due o tre immagini aggiuntive, quindi arrestare la sequenza di acquisizione delle immagini nel software.Un esempio di proliferazione batterica può essere osservato qui. Infine, per analizzare le immagini, utilizzare il menu soglia di regolazione immagine di ImageJ per convertire le immagini in formato binario. Successivamente, nel menu analizza, sotto impostazione misurazione, selezionare la misurazione dell'area.Quindi utilizzare lo strumento di analisi delle particelle per determinare automaticamente la dimensione delle colonie. Dopo cinque o sette ore si formano grandi microcolnie sulla superficie cellulare, indipendentemente dal fatto che il flusso venga mantenuto o meno a questo punto. Per misurare la resistenza delle microcolnie al flusso, acquisire innanzitutto due o tre immagini di entrambe le cellule mediante contrasto di fase e dei batteri mediante fluorescenza GFP.Applicare uno stress meccanico elevato per cinque minuti ed acquisire immagini a fluorescenza con un'acquisizione ogni cinque secondi. Arrestare lo stress meccanico spegnendo la pompa a siringa. Acquisire altre due o tre immagini, quindi interrompere la sequenza di acquisizione delle immagini tramite il software prima di raccogliere il mezzo per un saggio di semina.Prima di tutto, rimuovere il tubo di uscita avendo cura di non svuotare il canale. Aggiungere mezzo fresco preriscaldato per riempire le pozzette. Successivamente, rimuovere il tubo di ingresso e raccogliere il mezzo rimanente con una micropipetta, trasferendolo in un tubo da microcentrifuga. Per rimuovere tutto il mezzo residuo dal canale, risciacquare la microvetrina due volte aggiungendo 120 microlitri di PBS nel canale.Inclinare il vetrino due volte e scartare il mezzo. Per raccogliere le cellule infette, aggiungere 50 microlitri di tripsina EDTA al vetrino microscopico e incubare per cinque minuti a 37 gradi per staccarle dal canale, quindi mescolare questo campione staccato con una sospensione raccolta nel passaggio precedente. Dopo aver effettuato un’opportuna diluizione seriale in PBS, depositare frazioni di 10 microlitri su piastre con agar GCB e incubare in triplice replicato a 37 gradi Celsius con 5% di CO2 per tutta la notte.Il giorno successivo determinare il numero di unità formanti colonie per valutare il distacco batterico dai microcoloni. Infettare le cellule nella camera a flusso come in precedenza, a flusso ridotto di 3,5 millilitri all'ora; dopo 30 minuti, rimuovere i batteri non legati aumentando il flusso a cinque millilitri al minuto per un periodo di due minuti, quindi riportare il flusso a 3,5 millilitri all'ora e lasciare proseguire l'infezione per due ore. Successivamente, ogni ora, raccogliere una goccia di mezzo uscente dalla camera a flusso in una provetta per microcentrifuga per quattro ore.Dopo aver raccolto tutti i campioni, determinare il numero di unità formanti colonie come in precedenza. Questa è una rappresentazione grafica dell'adesione iniziale dei batteri sulla superficie cellulare. Ogni linea del grafico rappresenta il numero cumulativo di batteri legati in un determinato campo in funzione del tempo.I valori di tre campi sono indicati per dare un'idea della variabilità tra campi che ci si aspetta dopo la proliferazione sulla superficie cellulare. La resistenza meccanica delle microcolonie è stata testata aumentando il livello di stress di taglio fino a 10 dine per centimetro quadrato; mentre le microcolonie di tipo selvatico sono resistenti, le microcolonie formate dal mutante pill v vengono interrotte dall'aumento del flusso. Questo mutante non induce il rimodellamento della membrana plasmatica all'interno delle microcolonie ed è pertanto più sensibile all'aumento dello stress di taglio dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ad altri ricercatori nel campo delle malattie infettive per esplorare l'impatto dello sforzo di taglio sull'interazione di diversi patogeni con vari tipi cellulari. Non dimenticare che lavorare con patogeni umani può essere estremamente pericoloso e che precauzioni adeguate, come misure di livello due o tre, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Ditkowski, B., et al. Un modello in vitro di un sistema di perfusione a placche parallele per studiare l'aderenza batterica ai tessuti dell'innesto. J. Vis. Esp. (2019).Questo video dimostra il metodo di utilizzo di una camera di flusso a piastre parallele per perfondere batteri marcati con fluorescenza su tessuti di innesto vascolare, consentendo un'analisi controllata dell'adesione batterica e della patogenesi precoce in condizioni di flusso di taglio.

Modello in vitro a flusso parallelo a placche per studiare l'adesione batterica in una biopsia tissutale

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Per studiare l'interazione dei batteri con i vasi sanguigni sottoposti a stress di taglio, vengono descritti una camera di flusso e un modello di microscopia intravitale mesenterica in vivo che consentono di sezionare i fattori batterici e dell'ospite che contribuiscono all'adesione vascolare.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

L'attaccamento batterico alle cellule ospiti è un passaggio fondamentale durante la colonizzazione e l'infezione dell'ospite. Questo protocollo descrive la generazione di adesine ricombinanti accoppiate a polimeri come materiali biomimetici che consentono l'analisi del contributo delle singole adesine a questi processi, indipendentemente da altri fattori batterici.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

aderenze superficie cellulare sono centrali in meccanotrasduzione, in quanto trasmettono tensione meccanica e avviare le vie di segnalazione coinvolte nella omeostasi dei tessuti e lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo per sezionare i percorsi biochimici che si attivano in risposta a tensione, utilizzando microsfere magnetiche rivestite ligando e di applicazione della forza di recettori di adesione.

Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l'effetto di rigidità di matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Qui, descriviamo l'uso di un bioreattore di throughput più elevato microfluidici accoppiato con un microscopio a fluorescenza per l'analisi degli effetti di sollecitazione di taglio su biofilm di Pseudomonas aeruginosa che esprimono le proteine fluorescenti verde, compreso lo strumento istituito, la determinazione delle proprietà morfologiche, tasso di crescita e copertura di biofilm.

Live Cell analisi della sollecitazione di taglio su Pseudomonas aeruginosa utilizzando un sistema di microfluidica superiore-Throughput automatizzato

Questo metodo è utile per quantificare la dinamica precoce dell'adesione cellulare e la diffusione delle cellule dipendenti dall'ancoraggio sulla fibronectina. Inoltre, questo saggio può essere utilizzato per studiare gli effetti dell'omeostasi redox alterata sulla diffusione cellulare e/o sulle vie di segnalazione intracellulare correlate all'adesione alle cellule.

Esame della dinamica dell'adesione cellulare e della diffusione delle cellule epiteliali su fibronectina durante lo stress ossidativo

Questo protocollo presenta le procedure sperimentali per eseguire il test dell'impronta di adesione per visualizzare gli eventi di adesione durante l'adesione a laminazione rapida delle cellule.

Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

Scopri come studiare l'adesione batterica sotto stress di taglio usando camere a flusso e cellule endoteliali. Questo metodo permette di analizzare la colonizzazione batterica in condizioni fisiologiche realistiche.

L'introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

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