L'introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

Questo video mostra una procedura per studiare gli effetti dello stress puro sull'adesione batterica. Durante una grave infezione con un patogeno batterico come il nice sirium mens, l'agente patogeno raggiunge il flusso sanguigno lì, si attacca e colonizza le cellule ospiti mentre sotto stress meccanico dal flusso sanguigno a seguito della proliferazione, alcuni batteri si staccano e colonizzano nuovi siti e il ciclo ricomincia per studiare i fattori che influenzano l'adesione batterica alle cellule ospiti. Le cellule endoteliali vengono introdotte nelle camere di flusso monouso e nella coltura per consentire alle cellule di raggiungere la confluenza.

Vengono aggiunti batteri fluorescenti e lo stress puro viene controllato sperimentalmente. Utilizzando una pompa a siringa, l'adesione dei batteri alle cellule ospiti e la proliferazione vengono seguite al microscopio. I video risultanti vengono analizzati per determinare l'effetto dello stress di taglio sul processo di colonizzazione dell'endotelio.

Questa procedura può essere molto utile per studiare la patogenesi della meningite di Nizza, ma può essere utilizzata anche per altri batteri che sono sottoposti a stress da taglio durante il processo di patogenesi. Questa tecnica può essere un po' complicata da fare, in particolare quando si tratta di introdurre bolle nel sistema, il che può essere un problema. Quindi oggi a dimostrare la procedura sarà mega, uno studente di dottorato che lavora nel mio laboratorio.

Gli esperimenti descritti in questo video sono stati eseguiti utilizzando cellule coltivate in un micro vetrino IDI sei 0,4 costituito da un vetrino sterile monouso in plastica contenente sei canali lunghi 17 millimetri e larghi 3,8 millimetri e profondi 0,4 millimetri. Ogni canale ha due porte di accesso con adattatori per esche, una su ciascuna estremità per introdurre celle UVE, pipettare 30 microlitri di una volta 10 per la sospensione di sei celle in ciascuno dei canali. Sul vetrino, lasciare che le celle aderiscano per tre ore a 37 gradi e un incubatore umidificato con un'atmosfera del 5% di CO2.

Dopo l'incubazione, aggiungere altri 120 microlitri di endo SFM. Per riempire i pozzetti, le celle dovrebbero formare un monostrato sub confluente dopo circa 20 ore. Nel frattempo, la striscia GFP che esprime una bella meningite da sirium sulle APL, il batterio è un patogeno umano.

Pertanto, qualsiasi manipolazione di questo microrganismo deve essere eseguita in una struttura di sicurezza di livello due con personale addestrato che indossa camice e guanti, si raccomanda la vaccinazione del personale contro il gruppo sierologico utilizzato. Ecco il ceppo 8 0 1 3. L'espressione della GFP viene coltivata sotto il controllo di una striscia di promotore inducibile da IPDG.

I batteri su GC BPL contenenti integratori Kellogg e cinque microgrammi per millilitro di cloramfenicolo in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di CO2 per 16 ore. Una volta stabilite le colture cellulari di mammifero, i batteri vengono aggiunti alle cellule ospiti nel canale. In preparazione per il test a flusso, utilizzando un circuito di inoculazione, raccogliere i batteri dalla capsula di Petri, trasferirli in una provetta conica da 50 millilitri contenente colture cellulari endoteliali preriscaldate e integrate.

Endo SFM medio. Regolare la densità ottica a un OD 600 di 0,05 diluendo il campione nello stesso mezzo fino a un volume finale di cinque millilitri. Per indurre l'espressione della GFP, aggiungere IPTG a una concentrazione finale di un millimolare e incubare la coltura per 120 minuti.

In un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius al 5% di CO2 con agitazione delicata. Posizionare il micro vetrino con una coltura di cellule endoteliali preparate in precedenza sul tavolino di un microscopio invertito dotato di una piattaforma riscaldata per mantenere la temperatura del campione a 37 gradi Celsius. Versare l'endo SFM preriscaldato integrato con il 2% di FBS in un altoparlante di vetro sterile e riempire la siringa da 50 millilitri tirando lo stantuffo.

Il tubo di ingresso è collegato a un rubinetto di arresto a tre vie. Quindi, collegare il tubo di ingresso alla siringa e premere lo stantuffo per riempire il tubo con il fluido. Collegare con cautela l'altra estremità del tubo di ingresso alla micro slitta utilizzando i connettori ad angolo retto forniti.

Evitare di introdurre aria nella camera. Posizionare la siringa sulla pompa, quindi posizionare una siringa tagliata da un millilitro sulla fessura disponibile sul rubinetto di arresto come serbatoio. Quindi fissare il tubo di uscita all'altra estremità del canale e riempire con cura il canale con il fluido spingendo lo stantuffo della siringa a una distanza di circa un centimetro dall'uscita della camera.

Misurare l'OD batterico 600 e regolarlo a 0,15 e l'endo SFM contenente il 2% di FBS come prima, agitare vigorosamente il campione per distruggere gli aggregati batterici. Successivamente, utilizzando una pipetta monouso per pascoli in plastica, trasferire 100 microlitri di endos fm, integrati con il 2% di terreno FBS nel serbatoio. Quindi aspirare 100 microlitri di soluzione batterica dalla parte superiore della soluzione vortex e aggiungerla al serbatoio.

Ruotare con cautela il rubinetto, iniettare i batteri nella camera del micro vetrino per consentire l'adesione in presenza di un livello di stress controllato della quota. Introdurre endo SFM contenente il 2% di FBS nella camera utilizzando la pompa a siringa a 3,5 millilitri all'ora per 15 minuti. Questo video viene accelerato 60 volte.

La durata reale è di 10 minuti. Dopo questa fase, l'adesione e il distacco dei batteri alle cellule ospiti in varie condizioni possono essere valutati e descritti nelle prossime sezioni del video. Per quantificare l'adesione iniziale dei singoli batteri alle cellule ospiti, iniziare ad acquisire immagini dopo 15 minuti di flusso mentre il liquido è ancora in circolazione, acquisire immagini di 10 campi casuali per determinare il numero medio di batteri aderenti per campo visualizzato.

Inizia aprendo il software Image Day e apri l'immagine da analizzare. Inizia facendo clic sul menu immagine e selezionando. Regola il contrasto della luminosità.

Ottimizza la visualizzazione dei singoli batteri fluorescenti aderenti sullo sfondo regolando i livelli di intensità spostando il cursore. Quindi, nel plug-in, analizza il menu del contatore delle celle. Apri lo strumento contacellule, inizializza l'immagine, scegli l'oggetto, il tipo e fai clic su ogni singolo batterio.

Il numero totale di batteri appare nella finestra. Infine, esporta i dati per ogni immagine in excel e media per quantificare il numero medio di batteri aderenti per campo per misurare la resistenza dei singoli batteri aderenti al flusso. Dopo i primi 15 minuti di programma di flusso, la pompa a siringa si configura per generare una sollecitazione di taglio che va da tre a 100 centesimi per centimetro quadrato per cinque minuti.

Alla fine dei cinque minuti, interrompere il flusso e acquisire e analizzare 10 campi casuali come prima per determinare il numero medio di batteri rimanenti per campo. Dopo i primi 15 minuti di flusso, regolare la pompa a siringa in base alla sollecitazione di taglio selezionata. Lascialo scorrere per diverse ore, registrando le immagini a una velocità di un fotogramma ogni cinque minuti.

Idealmente, è possibile seguire diverse posizioni se il microscopio è dotato di una piattaforma XY motorizzata. Dopo la videomicroscopia, fermare lo stress puro e puro spegnendo la pompa a siringa. Acquisire immediatamente due o tre immagini aggiuntive, quindi interrompere la sequenza di acquisizione delle immagini sul software.

Un esempio di proliferazione batterica può essere visto qui. Infine, per analizzare le immagini, utilizzare il menu della soglia di regolazione dell'immagine di J per convertire le immagini in binarie. Quindi, nel menu Analizza sotto Imposta misurazione, selezionare la misurazione dell'area.

Quindi utilizzare lo strumento di analisi delle particelle per determinare automaticamente la dimensione delle colonie. Grandi micro colonie si formano sulla superficie cellulare dopo cinque-sette ore, indipendentemente dal fatto che il flusso sia mantenuto o meno a questo punto. Per misurare prima la resistenza delle microcolonie al flusso, acquisire due o tre immagini di entrambe le cellule mediante contrasto di fase e dei batteri mediante fluorescenza GFP.

Applica un'elevata sollecitazione di taglio per cinque minuti e scatta immagini a fluorescenza a un fotogramma ogni cinque secondi. Arrestare lo sforzo di taglio spegnendo la pompa a siringa. Acquisire due o tre immagini aggiuntive e quindi interrompere la sequenza di acquisizione delle immagini sul software per raccogliere il terreno per un saggio di placcatura.

Per prima cosa, rimuovere il tubo di uscita facendo attenzione a non svuotare il canale. Aggiungere il terreno fresco preriscaldato per riempire i pozzetti. Quindi rimuovere il tubo di ingresso e raccogliere il terreno rimanente con una micropipetta e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga Per rimuovere il terreno rimanente dal canale, sciacquare due volte il micro vetrino aggiungendo 120 microlitri a PBS al canale.

Inclinare due volte il carrello e scartare il fluido. Per raccogliere le cellule infette, aggiungere 50 microlitri di tripsina EDTA al micro vetrino e incubare per cinque minuti a 37 gradi per staccarle dal canale e mescolare questo campione staccato con una sospensione raccolta nel passaggio precedente. Dopo aver eseguito la diluizione in serie in piastra PBS, frazioni di 10 microlitri su piastre agricole GCB e triplicato incubato a 37 gradi Celsius 5% CO2 durante la notte.

Il giorno successivo determinare il numero di unità formanti colonie per valutare il distacco batterico dalle micro colonie. Infettare le cellule nella camera di flusso come prima a basso flusso 3,5 millilitri all'ora dopo 30 minuti, rimuovere i batteri non legati aumentando il flusso a cinque millilitri al minuto per un periodo di due minuti, quindi tornare a basso flusso 3,5 millilitri all'ora e lasciare che l'infezione continui per due ore. Quindi, ogni ora, raccogliere una goccia di terreno che esce dalla camera di flusso in una provetta da microcentrifuga per quattro ore.

Una volta raccolti tutti i campioni, determinare il numero di unità formanti colonie come prima. Questa è una rappresentazione grafica dell'adesione iniziale dei batteri sulla superficie cellulare. Ogni linea del grafico rappresenta il numero cumulativo di batteri legati in un determinato campo in funzione del tempo.

I valori per tre campi sono indicati per dare un'idea della variazione da campo a campo che ci si aspetta dopo la proliferazione sulla superficie cellulare. La resistenza meccanica delle micro colonie è stata testata aumentando il livello di stress di taglio a 10 dines per centimetro quadrato, ma mentre le micro colonie di tipo sono resistenti, le micro colonie formate dal mutante della pillola v vengono interrotte dall'aumento del flusso. Questo mutante non riesce a indurre il rimodellamento della membrana plasmatica sotto le micro colonie ed è quindi più altamente sensibile all'aumento dello stress di taglio dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ad altri ricercatori nel campo delle malattie infettive per esplorare l'impatto dello stress da taglio sull'interazione di vari agenti patogeni con diversi tipi di cellule. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni umani può essere estremamente pericoloso e per precauzioni, come il livello due o tre, è necessario adottare sempre misure durante l'esecuzione di questa procedura.